表面展示猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1的重组杆状病毒及其免疫效果研究

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1能够介导宿主抵御PEDV感染的中和抗体的产生,是PEDV基因工程疫苗研究的重要靶抗原。将PEDV的S1基因克隆至杆状病毒基因组中,构建包含PEDV S1基因的重组杆状病毒,使S1蛋白表面展示表达。以该重组病毒作为活载体疫苗皮下接种BALB/c小鼠,验证S1蛋白在重组杆状病毒中的表达及其免疫原性。Western blotting分析被重组杆状病毒感染的Sf9细胞中,PEDV S1蛋白能有效表达且呈现大小分别约120 k D和150 k D的2条带,其中前者至少比预期大30 k D左右,推测重组S1蛋白在Sf9细胞中被高度糖基化修饰。重组杆状病毒的胶体金免疫电子显微镜观测结果显示S1蛋白展示于杆状病毒表面;间接ELISA试验结果证明重组杆状病毒可以诱导产生PEDV特异性抗体,抗体效价达到1∶5 000。血清中和试验及淋巴细胞增殖试验结果证明,该重组杆状病毒能够激发有效的体液免疫及细胞免疫反应,S1蛋白在重组杆状病毒表面展示表达并具有免疫原性。     

杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及免疫原性评估

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-s1,将其电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得了表达PEDV S1蛋白的重组乳酸茵杆菌.重组杆菌诱导后,经western blot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达.将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后于不同时间分别测定了粪便中特异性的sIgA和血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况.结果表明该重组干酪乳杆茵表达系统能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,在肠道可产生分泌型Iga抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫应答.表明所构建的重组干酪乳杆茵表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型猪流行性腹泻口服疫苗的研制奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1抗原表位的串联表达及免疫原性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性，试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上，然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组，分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原，检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明：重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达，并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应；首次免疫后第28天，S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。     

分泌抗猪流行性腹泻病毒中国变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以纯化的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中国变异株(CH/ZMDZY/11)S蛋白N端高变区(22-380aa)重组蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,以纯化CH/ZMDZY/11全病毒及带His标签的重组蛋白分别为筛选抗原,利用淋巴瘤杂交技术获得了一株稳定分泌抗S蛋白特异性单克隆抗体细胞株,命名为2D1。该株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价为1∶3 200,免疫球蛋白类型为IgM。ELISA检测该单抗与PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒的反应显著差异,可区分流行毒株和疫苗毒株;但该单抗用于Western blot不能区分PEDV流行株和疫苗株。ELISA及Western blot试验结果显示,该单抗有较好的PEDV特异性,可用于检测PEDV。     

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系，为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料，本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合，克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中，包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞，经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选，基因水平和蛋白水平表达验证，成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系，为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性分析

为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因。将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M。表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性。本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

改良QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法检测饲料中的7种镇静剂

本实验旨在建立以改良的QuEChERS作为前处理技术,结合高效液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS/MS)检测饲料中7种镇静剂的检测方法。样品加入乙腈提取,提取液经增强型基质去脂吸附剂(EMR-Lipid)脱脂,盐析后经PSA和C18吸附剂进一步净化浓缩,然后用高效液相色谱-串联质谱方法检测分析。结果表明:7种镇静剂为1~100μg/L时线性关系良好,相关系数均大于0.99,检出限为1.1~2.8μg/kg,定量限为3.7~9.3μg/kg。分别对配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料进行3个水平的加标回收实验,平均回收率为84.7%~96.5%,相对标准偏差为3.2%~10.8%。该方法前处理方法快速、简便、灵敏度高,适用于饲料中多种残留镇静剂的同时测定。     

人参皂苷Rg1联合重组大肠杆菌不耐热肠毒素rLTB作为滴鼻免疫佐剂在小鼠体内的作用研究

为探究人参皂苷Rg1和重组大肠杆菌不耐热肠毒素rLTB联合滴鼻免疫小鼠的佐剂效果,本研究以卵清白蛋白(OVA)为模式抗原,分别将生理盐水、OVA、OVA+Rg1、OVA+rLTB、OVA+Rg1-rLTB滴鼻免疫小鼠,共免疫3次。利用血液细胞分析仪分析小鼠外周血中白细胞的变化;荧光定量PCR检测小鼠脾细胞中细胞因子mRNA转录水平;ELISA法检测小鼠血清、胆汁、肺泡支气管和阴道黏液中IgA和IgG抗体水平。结果显示,与OVA单独免疫组相比,Rg1-rLTB能够明显促进小鼠中性粒细胞和中间细胞数量的增加(p<0.05),显著上调Th1、Th2和Th17型细胞因子的转录水平(p<0.05),明显提高血清和局部黏膜中的OVA特异性IgA和IgG抗体水平(p<0.05),并且Rg1-rLTB的复合佐剂效果比单独Rg1或rLTB更具优势。因此,Rg-rLTB可以作为一种新型的滴鼻免疫佐剂,值得进一步的深入研究。     

降低家禽养殖业沙门氏菌感染的研究进展

沙门氏菌是一种人畜共患病原体,食用生的或未煮熟的受污染家禽产品可导致人类急性胃肠炎。本综述总结了目前关于降低家禽养殖业沙门氏菌感染的研究,并对未来在家禽沙门氏菌控制领域的发展提出建议,包括常规的预防卫生措施,以及饲料和饮用水有机酸酸化等其它策略和基于被动免疫和主动免疫的免疫策略。另外,通过改变饲料原料成分和营养也可降低家禽对沙门氏菌感染的易感性。     

肌醇对鲫鱼组织脂肪、蛋白质氧化及抗氧化状态的影响

文章旨在探讨肌醇对鲫鱼组织器官脂肪、蛋白质氧化及抗氧化状态的影响。试验选择初始体重为(23.2±0.10)g的鲫鱼1680条,随机分为7组,每组4个重复,每个重复60条,试验共进行9周。对照组为基础日粮(肌醇含量为150mg/kg,计算值),处理1~6组分别在基础日粮中添加100mg/kg肌醇,使各处理组肌醇含量分别为250、350、450、550、650和750mg/kg。对照组肌肉丙二醛含量最高(P<0.05),且随日粮肌醇添加水平的升高而降低,其中550mg/kg肌醇组肌肉丙二醛含量最低(P<0.05)。肌醇组较对照组显著提高了肌肉抗羟自由基水平(P<0.05)。随着日粮肌醇水平升高至350mg/kg,肌肉超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽含量显著升高(P<0.05)。与对照组相比,肌醇组均显著提高了肌肉过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活力(P<0.05)。随着日粮肌醇水平升高至450mg/kg,小肠丙二醛含量显著降低(P<0.05),小肠过氧化物酶活力显著升高(P<0.05)。对照组肝脏MDA含量最高(P<0.05),之后随着肌醇水平升高至650mg/kg时显著降低(P<0.05)。随着日粮肌醇水平升高至350mg/kg,肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力显著升高(P<0.05),而对照组谷胱甘肽含量最低(P<0.05),450和550mg/kg肌醇组最高(P<0.05)。结论:鲫鱼日粮添加肌醇可以通过增强自由基清除能力,提高抗氧化酶活力,有效预防肌肉、小肠、肝脏的脂质过氧化和蛋白氧化。     

蚕丝织物和棉织物的热湿舒适性能分析

为了更好地了解多层天然织物的热湿性能,以蚕丝织物和棉织物为研究对象,以面密度作为归一化指标,对不同面密度(不同层数)蚕丝织物和棉织物的透气率、透湿量和热阻进行测试分析,在此基础上,通过回归分析分别建立织物面密度对透气率、透湿量、热阻的回归模型。结果表明,在测试条件下,织物面密度与透气率和透湿量呈乘幂负相关,与热阻呈线性正相关;相同面密度时,蚕丝织物的透气率和透湿量均大于棉织物;当面密度较小时,蚕丝织物的热阻比棉织物小,随着面密度的增大,蚕丝织物的热阻逐渐优于棉织物,且面密度越大,差异越明显。     

轮状病毒结构蛋白VP4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。     

犬基因组结构和多态性研究进展

家犬是最早被驯化的家养动物,通过选择进化和培育,世界上注册的已有超过400多个犬品种,每个品种都具有独特的生理、行为和形态特征。利用高密度芯片技术进行犬全基因组多态性分析,并通过基因组多态信息扫描定位功能基因成为热点,总结和综述了犬基因组结构变异和多态信息的研究进展,为开展家犬基因组学研究提供新的方法和思路。     

犬胆结石引发肝外总胆管阻塞的诊治

1例贵宾犬出现呕吐、食欲不振、可视黏膜黄染和明显腹痛;血常规显示轻度贫血和白细胞总数升高;血清生化显示丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素升高,C-反应蛋白显著升高,胰腺特异性脂肪酶异常;B超显示胆囊和总胆管扩张,胆囊及总胆管内有胆结石。确诊为胆结石并继发慢性胆囊炎、肝外总胆管阻塞、急性胰腺炎、肝损伤,采用胆囊摘除术及总胆管切开术将结石取出,术后该犬恢复良好。     

降低饲粮氮或/和磷含量并添加复合酶对生长猪生长性能、养分消化率和血清生化指标的影响

本试验旨在研究降低饲粮氮或/和磷含量并添加复合酶对生长猪生长性能、养分消化率和血清生化指标的影响。试验选择96头体重为(36.0±4.8)kg的生长猪,随机分为4组(每组3个重复,每个重复8头猪),分别饲喂不添加复合酶的正常饲粮(对照组)、添加复合酶的低氮饲粮(低氮组)、添加复合酶的低磷饲粮(低磷组)和添加复合酶的低氮低磷饲粮(低氮低磷组),试验期为37d。结果显示:各组间平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著差异(P>0.05)。低磷组和低氮低磷组生长猪的磷消化率显著高于对照组和低氮组(P<0.05)。除半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)和酪氨酸(Tyr)的消化率低氮低磷组显著高于对照组(P<0.05)外,其他氨基酸的消化率各组间均无显著差异(P>0.05)。低氮低磷组生长猪血清中钙含量显著高于对照组和低磷组(P<0.05),4组之间血清中总蛋白、磷、尿素氮含量与碱性磷酸酶活性均无显著差异(P>0.05)。结果表明,在适量降低生长猪饲粮中氮和磷含量的同时添加复合酶对生长猪的生长性能无显著影响,还可以提高磷的利用效率,减少粪便中氮和磷的排放。     

5种驱蚊产品对家蚕的熏蒸毒性测试

选取5种市售新型驱蚊液、驱蚊贴产品,在30℃环境中密闭熏蒸2龄起蚕和5龄第3 d蚕24 h,对家蚕成活率、结茧率和茧质影响较小,但含有避蚊胺(DEET)的驱蚊液会导致死笼率增高。