猪圆环病毒2型核酸疫苗的小鼠免疫保护试验

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗在小鼠攻毒试验中的免疫保护效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,扩增出ORF2基因及其截短基因8个片段(A(ORF2)、B(51-100aa)、C(101-150aa)、D(181-235aa)、E(151-200aa)、F(51-150aa)、G(101-235aa)、H(51-235aa)),将其插入到pcDNA3.0载体中,构建出真核表达质粒,并将其转染至PK-15细胞,用间接免疫荧光试验检测其瞬时表达情况。将试验小鼠随机分成9组,其中免疫组7组,阴阳性对照各1组,将纯化的真核表达质粒对小鼠进行组合免疫;二免后,用经处理过的PCV-2 GXWZ-2株阳性病料悬液腹腔注射免疫组和非免疫对照组小鼠,阴性对照组用生理盐水腹腔注射;其后进行体重记录、病理切片制作及PCR检测。结果表明:共有6个真核表达质粒成功在PK-15细胞中表达。在攻毒后的3周内,阳性对照组小鼠PCR诊断均为阳性;免疫组中,部分组小鼠在攻毒后第1周或在第2周为阳性,到第3周时各免疫组小鼠全部为阴性;阴性对照组始终为阴性。免疫组在病理保护学方面明显优于非免疫对照组,非免疫对照组的体重增长速率略低于免疫组和阴性对照组。由此可见猪圆环病毒2型核酸疫苗在小鼠攻毒试验中有明显的保护作用。     

融合基因Ghrelin/GHRH真核表达质粒的构建及其促生长效应

根据文献报道的猪Ghrelin与生长激素促释放激素(GHRH)基因序列,设计了含Ghrelin信号肽及Ghrelin与GHRH部分核苷酸序列及lin-ker序列等共233 bp的基因序列,通过基因合成的方法获得基因片段,并将其连入克隆载体pUC57中,经双酶切将其克隆至PCI真核表达载体中。经PCR、酶切和测序鉴定,证明融合猪Ghrelin和GHRH基因的真核表达载体pCI-Ghrelin/GHRH构建成功;提取PCI-Ghrelin/GHRH质粒并体内转染小鼠腿部肌肉组织,观察25 d内pCI-Ghrelin/GHRH质粒对小鼠体重的影响,结果表明:0~10 d试验组小鼠平均日增重高于pCI-Ghrelin-28aa组及生理盐水组,但试验组后期增重缓慢。     

堆型艾美耳球虫3-1E重组质粒微球的制备及体外释放试验

用聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）将鸡堆型艾美耳球虫重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E包封,采用水包油包水（W/O/W）双重乳化方法制备pcDNA3-3-1E/PLGA微球。通过正交试验设计优化PLGA微球制备工艺,考察PLGA浓度、聚乙烯醇（PVA）浓度、超声功率、复乳搅拌时间对评价指标（即微球粒径大小、包封率、载药量）的影响,确定制备微球的最佳工艺条件。测定微球的形态、粒径、完整性、质粒DNA包封率、载药量和释放程度;进行体外模拟鸡胃液和肠液试验,观察微球体外释药效果。结果显示,当PLGA浓度为8%、PVA浓度为1.5%、超声功率为60W、复乳搅拌6h为微球制备的最佳工艺参数,在光镜下呈散在圆形,粒径小于12μm。微球的包封率、载药量分别为84.25%和4.46%,裸质粒与微球中质粒超螺旋比例差距不显著,这表明在包被过程中的超螺旋质粒未发生明显的降解。在模拟鸡的胃肠液累积释放试验中,它的累积释放能力依次为pH 3.0〉pH 7.4,载药微球在模拟鸡的胃肠液中24h释放26.8%,模拟肠液中24h释放11.2%,30d时体外累积释放率为81.7%,表明微球具有一定的缓释效果。     

载副猪嗜血杆菌PLGA Omp16蛋白微球的制备及其免疫效果的初步研究

为研究载副猪嗜血杆菌(H. parasuis)外膜蛋白Omp16 PLGA微球的生物学特性,本研究以H. parasuis外膜蛋白Omp16为芯材,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为壁材,通过复乳溶剂挥发法制备PLGA微球疫苗。通过扫描电镜测定微球的形态、激光粒径仪测定微球的粒径分布。结果显示,PLGA微球呈球性,表面圆整,粒径分布较窄,平均粒径为5.2μm;采用BCA法测定微球的包封率和载药率,结果显示,微球的包封率为70.5%,载药率为5.78%;以透析释药法测定微球的体外释放特性,结果显示,微球体外释放42 d累计释放抗原95.3%。用该微球0.2 mg/次,免疫小鼠二次(间隔14 d)后,采用ELISA法测定小鼠抗H. parasuis IgG水平,结果显示,微球佐剂组小鼠H. parasuis IgG抗体水平显著高于灭活疫苗组(p0.01);腹腔注射H. parasuis LY02株(血清5型)进行攻毒保护试验,结果显示,微球佐剂组小鼠攻毒保护率(81.8%)显著高于灭活疫苗组(63.6%)(p0.05)。以上试验结果表明,制备的PLGA微球具有良好的缓释性能,能增强小鼠体液免疫应答,提高H. parasuis攻毒保护率。本研究为H. parasuis亚单位微球疫苗的制备奠定基础。     

PCI—Ghrelin-28aa质粒对仔猪生长性能的影响

提取并纯化了大量的PCI-Ghrelin-28aa质粒,选取了同日龄的断奶仔猪8只(雌雄各4只),按体质量、性别等分到质粒及生理盐水2个处理组中,进行对比试验,试验期为63 d,分别在0、7、21、35、49、63 d采样并测定相应的指标.结果表明,PCI-Ghrelin-28aa质粒对猪具有明显的促生长作用,作用时间至少可达1个月;PCI-Ghrelin-28aa质粒可提高猪对粗蛋白质的消化率,降低料重比;PCI-Ghrelin-28aa质粒具有增强猪机体免疫力的趋势.     

生长激素释放肽-6缓释微球的制备及其对动物生长的影响

以生物降解材料乳酸乙醇酸共聚物(PLGA,LA-GA 8515)为载体,采用复乳-液中蒸发法制备含生长激素释放肽-6的乳酸乙醇酸共聚物微球,并通过体外药物释放试验评价载药微球的释药特征.结果得到收率、粒径大小和分布及含药量均满意的微球,其中包封率为100%,平均体积径为3.45μm,收率为79%.在37℃、pH7.0的生理等渗缓冲液中,首日释药19.19%,其后以平均日释药3.23%的速度释药25 d.小鼠肌肉注射微球30 d后,累积增重比注射生长激素释放肽-6、生理盐水分别高22.56%(P<0.05)和53.17%(P<0.01).结果表明,生长激素释放肽-6乳酸乙醇酸共聚物微球有望发展成为新型长效制剂.     

microRNA-124-3p调控H1N1亚型猪流感病毒致小鼠肺损伤的研究

为研究microRNA-124-3p（miR-124-3p）对H1N1亚型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）感染小鼠所致肺损伤的调控作用，本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体，通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型，试验分3组：过表达组、抑制组和对照组。48 h后，各组小鼠鼻腔接种H1N1亚型SIV，每只10⁵ EID₅₀（50 μL）。连续观察14 d，计算小鼠平均体重变化率、观察病理切片并测定相关炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量。结果显示，已成功将pre-miR序列及其sponge序列插入腺病毒的穿梭质粒，并将其共转染293A细胞。实时荧光定量PCR检测证实，与对照组相比，过表达组和抑制组小鼠黑色素瘤细胞miR-124-3p表达水平分别极显著升高（P<0.01）和显著降低（P<0.05），表明成功构建腺病毒表达载体。过表达组、抑制组和对照组小鼠体重变化率分别为－5.5%、－12.4%和－8.6%。抑制组和对照组均可见肺泡壁增厚，其间有多量淋巴细胞浸润，部分肺泡内出现纤维蛋白渗出，且抑制组病理变化更为严重，肺泡中还有大量的红细胞浸润；而过表达组仅有少量的淋巴细胞浸润，肺脏组织较正常。与对照组相比，过表达组检测的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）；抑制组炎症相关炎症因子mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）。本试验结果表明，miR-124-3p对H1N1亚型SIV感染小鼠所致的肺脏炎症因子的表达具有抑制作用，同时能减轻肺脏病理损伤。     

PPR与RP病毒N蛋白片段的克隆表达与纯化

目的选取PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的片段进行重组表达。方法对PPRV和RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa蛋白片段基因进行大肠杆菌偏爱密码子优化后人工合成,利用分子生物学技术,将目的基因分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),诱导表达并纯化PPRV与RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa片段。结果得到了分子量分别约17.8kD、20.6kD的各两段融合蛋白。结论本研究成功表达了PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的51-175aa和376-525aa蛋白片段,为制备能区别PPR和RP病毒的特异性单抗提供了抗原。     

猪多杀性巴氏杆菌重组抗菌肽ABC转运体ATP结合蛋白诱导的免疫保护研究

为研究猪多杀性巴氏杆菌(Pm)重组抗菌肽ABC转运体ATP结合蛋白的免疫保护性,本研究采用PCR方法扩增该蛋白基因,并将其克隆于pET-28a(+)中构建重组质粒pET-ABP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达。分析表明,猪Pm抗菌肽ABC转运体ATP结合蛋白基因为696 bp,编码231 aa,不同血清型的该蛋白基因推导氨基酸序列同源性达99%以上。表达的蛋白分子量约为27 ku。动物实验表明,实验组小鼠三免后第14 d其血清IgG抗体水平显著升高,明显高于对照组。对照组攻毒后3 d存活率为20%,7 d全部死亡;免疫组小鼠攻毒后3 d存活率为80%,7 d存活率为40%。该研究为进一步研制Pm的混合疫苗奠定了基础。     

活体电穿孔方法提高外源GRF基因在小鼠肌肉组织中的表达

向小鼠后肢小腿肌注pGRF表达质粒并加以电穿孔条件,注射剂量分别为5,10,50μg,于注射前及注射后10,20,30d测体质量,并采血分离血清测血清GRF水平。结果显示,5μgpGRF质粒电穿孔组注射后10dGRF分别比对照组、5μgpGRF质粒组升高44.73%(P0.05),12.86%(P0.05);血清中GRF水平升高。30d累积增重,5μgpGRF质粒电穿孔组分别比对照组、5μgpGRF质粒组高11.46%,6.75%(P0.05);10μgpGRF质粒组分别比对照组和10μgpGRF质粒电穿孔组高19.52%(P0.05),19.42%(P0.05)。50μgpGRF质粒组45d累积增重分别比对照组、pGRF质粒电穿孔组高14.00%,12.00%(P0.05)。结果表明,电穿孔处理可提高GRF基因在小鼠肌肉中的表达。     

Carboplatin sustained delivery system using injectable microspheres

A controlled carboplatin delivery system using biodegradable polymer has been used in this study. The purpose was to evaluate the local and systemic effects of injectable, biodegradable microspheres containing carboplatin when injected as aqueous suspension subcutaneously in rats. Biocompatibility and toxicity of empty microspheres and microspheres loaded with carboplatin were evaluated by clinical and histological examination. The diffusion of carboplatin in tissues and time of drug release were evaluated by platinum determination in plasma and tissues over the time. The results of the study suggest that microspheres provide a sustained slow release of carboplatin and that multiple inoculations of microspheres containing drug and no evidence of local or systemic toxicity is found. This device may be useful in the treatment of solid tumours.     

Production and characterization of biodegradable Povidone-iodine microsphere as a intramammary disinfectant

Microspheres composed of biocompatible, biodegradable poly DL-lactide-co-glycolide (DL-PLGA) and Povidone-iodine were evaluated as an intramammary disinfectant delivery system in vitro prior to infusion into mammary glands. Microsphere was prepared by solvent evaporation method and particle size, morphology and in vitro release kinetics were examined. The microspheres were ranged in size from 25 microm to 155 microm (mean diameter = 65.7 microm). Povidone-iodine was dispersed on the surface of microsphere and microsphere was spherical in shape with a smooth surface. The yield of microsphere was 57.3% and the encapsulation efficiency was 69.6%. In in vitro release study, a burst effect (50.9%) was observed during the first two days and a sustained release then continued for the next 28 days. Results of the present study demonstrated that microsphere have the potential for new intramammary disinfectant formulations that can provide increased efficacy of therapy against mastitis pathogens.     

培养液及血清浓度对山羊孤雌胚胎体外培养的影响

试验比较了在SOFaa，CRlaa，mCRlaa3种培养液中添加不同浓度的成年山羊血清(NGS)对山羊孤雌胚胎进行体外培养的效果。结果表明：在3种培养液中，添加10％的NGS对山羊孤雌胚胎的体外发育效果较好，囊胚率分别可达62．79％(81／129)、53．52%(38／71)、13．64％(12／88)；mCRlaa组囊胚发育率和囊胚细胞数显著低于SOFaa组和CRlaa组，SOFaa组优于CRlaa组．但SOFaa组和CRlaa组间无显著差异。在现有试验条件下，以在SOFaa培养液中．山羊孤雌胚胎的体外培养的第72小时时加入10％的NGS的发育效果较好，囊胚率可达62．79％。     

Genetic and antigenic diversity in avian infectious bronchitis virus isolates of the 1940s

In order to verify a commonly held assumption that only Massachusetts (Mass) serotype of infectious bronchitis virus (IBV) was prevalent in the United States between the 1930s (when IBV was first isolated) and the 1950s (when the use of commercial IBV vaccines began), we examined 40 IBV field isolates from the 1940s. Thirty-eight of those isolates were recognized as Mass serotype viruses based on their reactivity to Mass-specific monoclonal antibody (Mab) and neutralization by Mass-specific chicken serum. The remaining two isolates, N-M24 and N-M39, that did not react with Mass-specific Mab, resisted neutralization by Mass-specific chicken serum, and were neutralized only by homologous chicken antibody were identified as non-Mass IBV. When the first 900 nucleotides (nt) from the 5'-end of the spike (S1) glycoprotein gene and their deduced amino acid (aa) sequences were compared, the two non-Mass isolates differed from each other by 24% and 28%, respectively. In a similar comparison, the non-Mass viruses N-M24 and N-M39 differed from M28, a Mass-type isolate from the 1940s, by 21% and 22% (nt) and 28% and 27% (aa), respectively. These data indicate that antigenic and genetic diversity among IBV isolates existed even in the 1940s. Interestingly, when the N-terminal region of the S1 of M28 was compared to that of M41, a prototype Mass virus that has undergone countless number of in vivo and in vitro host passages, the two viruses differed by only 2% (nt) and 4% (aa). This finding suggests that frequent genetic changes are not inherent in all IBV genomes.     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV)SY-99株由本室分离，提取SY－99株的基因组DNA，利用PCR扩增出全长NS1基因，将该基因克隆到 核表达载体pET28a中并测序。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸，氨基酸序列中含有PP 制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点，分别位于356－359、446－449、513－516位氨基酸处，SY－99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2－1、NADL2－2、Kresse株核苷酸同源性分别为98％、99％、99％，氨基酸同源性分别为97％、99％、995。SN1基因的克隆为研究NS1在PPV的复制中所发挥的功能及利用人工表达的NS1来制备诊断抗原提供了可能。     

GHRP温控缓释系统的建立及对动物生长的影响

在体凝胶(In situgel)在药学、生物技术领域各个方面的应用,包括药物输送、细胞膜包覆和组织修复等.本试验采用了温敏缓释栽药系统,制备了GHRP-6温敏缓释系统,研究其对动物生长的影响.结果显示,Vc系獭兔肌注GHRP-6温敏缓释凝胶7、14、21、28 d后,2、4 g/L组累积增重效果分别比生理盐水组高25.83%～63.37%;肌注GHRP-6温敏缓释凝胶血清IGF-I浓度:注射7 d后,2,4 g/L组分别比生理盐水组高16.31%(P<0.05),27.98%(P<0.01);注射14 d后,2、4 g/L组分别比生理盐水组高37.43%(P<0.01)、47.17%(P<0.01);注射28 d后,2、4 g/L组分别比生理盐水组高31.71%(P<0.01)、40.14%(P<0.01).试验证明,GHRP-6温敏缓释凝胶能显著增高血清中IGF-I浓度,促进Vc系獭兔生长,血清中IGF-I浓度与Vc系獭兔累积增重呈正相关.     

牛体外受精卵的二步法培养体系的研究

以CR1aa为基础培养液,采用二步法对牛体外受精卵进行体外培养,完善牛体外受精卵的培养体系.实验一:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa 3 mg/mLBSA培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的囊胚率显著高于对照组,但卵裂率和囊胚孵化率无显著差异.实验二:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的卵裂率显著高于对照组,但囊胚率和囊胚孵化率差异不显著.实验三:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1mmol/L GSH培养,处理组前3 d为CR1aa 0.1 mmol/L GSH培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1 mmol/L GSH.处理组的卵裂率显著高于对照组,囊胚率极显著高于对照组,但囊胚孵化率差异不显著.结果表明,GSH与二步法培养系统结合相对于传统的一步法培养系统更适于牛体外受精卵的体外培养.     

星点设计-效应面法优化硫氰酸红霉素肺靶向明胶微球的配方

用星点设计-效应面法优化硫氰酸红霉素明胶微球的处方,以期得到分散性好、粒径符合要求的明胶微球。本研究采用乳化-化学交联法制备,以明胶浓度、油水比例、乳化剂浓度为自变量,微球的平均粒径、载药量、包封率、跨距为因变量对自变量的各水平进行多元线性回归和二项式拟合。根据因变量效应面法选取较佳工艺,并在此基础上制备了硫氰酸红霉素微球,且进行了优化处方的验证。结果显示,二项式模型拟合效果较多元线性回归要好,最佳优化处方为明胶浓度0.156g/mL、油水比例12∶2、乳化剂浓度0.03g/mL,根据优化工艺制备的微球分散性好,平均粒径、载药量、跨距、包封率分别为12.51μm、21.28%、1.51和84.39%。体外释药特性研究表明,该微球符合一级方程规律,具有明显的缓释效果。通过星点设计-效应面法成功建立了处方优化模型,且预测性良好。     

鸡传染性法氏囊病毒基因组A节段编码前体多聚蛋白的遗传踪迹分析

为研究鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)毒力变异的分子机理,本实验采用进化踪迹分析方法对GenBank中登录的28个毒力不同的IBDV参考病毒株的基因组A节段编码的前体多聚蛋白(NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH)推导的氨基酸序列进行分析。结果表明超强IBDV与标准IBDV的差异位点集中在第299位、451位、680位、715位和751位氨基酸上;致弱IBDV与标准IBDV的差异位点在第242位、253位、330位和981位氨基酸。该结果为进一步研究IBDV的毒力变异奠定基础。