新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

小反刍兽疫病毒四川简阳株N基因的系统进化分析

为了调查小反刍兽疫病毒四川简阳株(SCJY株)的分子遗传特征,我们对四川简阳发病羊鼻拭子中的小反刍兽疫病毒N基因进行了遗传进化分析。通过RT-PCR、克隆测序获得SCJY株N基因序列,使用DNASTAR软件将其与GenBank中的15条参考株序列进行同源性比对,使用MEGA6软件进行系统进化分析。结果显示:SCJY株N基因序列全长1578nt,与参考株的核苷酸同源性为88.9%～100%,氨基酸同源性为92.8%～100%,与2013～2014年小反刍兽疫中国流行毒株高度同源;系统进化分析将16个毒株N基因划分为4个谱系,SCJY株属于Ⅳ系。     

小反刍兽疫病毒新疆株的N基因序列分析

为了分析小反刍兽疫病毒(PPRV)新疆株的分子演变特点,从Gen Bank数据库中下载所有国家全部PPRV的N基因全序列,应用DNAStar软件进行序列分析。结果显示:PPRV中国新疆株,与中国内地流行毒株核苷酸同源性最高,为99.2%~99.9%;与之前中国西藏毒株核苷酸同源性为98.1%;与中国所用疫苗株核苷酸同源性为93.6%。与其他国家毒株相比,核苷酸同源性最低的是韩国毒株,同源性最高的是印度毒株。N基因系统进化关系分析显示,PPRV中国新疆株属于基因Ⅳ系。N蛋白氨基酸同源性结果与核苷酸比对结果相似。PPRV中国新疆株存在一定程度变异,可能为周边国家传入。     

基于N基因的小反刍兽疫病毒贵州流行株分子特征与分群研究

为探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)贵州流行株N基因分子特征和分群,试验设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)临床样本进行N基因扩增,克隆至pMD19-T载体,对阳性重组质粒进行测序,应用DANStar软件对测序序列和参考序列进行核苷酸同源性、氨基酸同源性、变异位点及系统进化树分析。结果显示:PPRV贵州流行株N基因扩增长度为1 578bp,其相互间核苷酸、氨基酸同源性分别为99.6%~100.0%及99.2%~100.0%,与国内参考株N基因的核苷酸序列(97.7%~99.9%)及氨基酸序列(98.3%~100.0%)同源性较国外参考株(88.5%~97.7%和92.2%~98.5%)高;PPRV贵州流行株N基因编码的氨基酸同疫苗株Nigeria 75-1相比存在26个位点突变,但没有氨基酸的缺失或增加;基于N基因系统进化分析显示,PPRV贵州流行株同国内参考株处于同一个进化分支,但与国外参考株处于不同进化分支;其属于病毒进化的Ⅳ基因群,与国内参考株处于同一系统分群,但与疫苗株Nigeria 75-1(Ⅰ基因群)处于不同基因群。     

基于N基因的小反刍兽疫病毒贵州流行株分子特征与分群研究

为探讨小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）贵州流行株N基因分子特征和分群,试验设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）临床样本进行N基因扩增,克隆至pMD19-T载体,对阳性重组质粒进行测序,应用DANStar软件对测序序列和参考序列进行核苷酸同源性、氨基酸同源性、变异位点及系统进化树分析。结果显示：PPRV贵州流行株N基因扩增长度为1 578 bp,其相互间核苷酸、氨基酸同源性分别为99.6%~100.0%及99.2%~100.0%,与国内参考株N基因的核苷酸序列（97.7%~99.9%）及氨基酸序列（98.3%~100.0%）同源性较国外参考株（88.5%~97.7%和92.2%~98.5%）高;PPRV贵州流行株N基因编码的氨基酸同疫苗株Nigeria 75-1相比存在26个位点突变,但没有氨基酸的缺失或增加;基于N基因系统进化分析显示,PPRV贵州流行株同国内参考株处于同一个进化分支,但与国外参考株处于不同进化分支;其属于病毒进化的Ⅳ基因群,与国内参考株处于同一系统分群,但与疫苗株Nigeria 75-1（Ⅰ基因群）处于不同基因群。     

小反刍兽疫病毒N基因部分序列分子演化规律

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从NCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近,2013-2015年中国西藏流行株与2012年巴基斯坦毒株遗传关系最近。中国小反刍兽疫主要发生于山羊,2015年新疆巴州毒株来自阿尔卑斯野山羊,与2013年以来的毒株在同一分支。China-BJ_2014与China-XJBZ_2015的遗传距离为0.011 7。中国两簇PPRV分支均与西部邻国毒株遗传关系最近,目前出现多宿主和变异性的流行特点,本研究为有效防控PPRV疫情提供基本的科学依据。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

小反刍兽疫疫情流行毒株P基因序列分析

为分析我国2013年小反刍兽疫(Peste Des Petits Ruminants,PPR)大流行时期各毒株的进化关系,从NCBI下载不同地区的28株PPRV毒株,利用DNAStar分子生物学软件进行PPRV P基因序列分析。结果显示,2013年我国PPR疫情各毒株间P基因核苷酸同源性范围为99.6%~100%,与西藏毒株同源性范围为97.1%~97.5%,与国外毒株同源性范围为89.2%~98.2%;2013年PPR疫情各毒株间P蛋白氨基酸同源性范围为95.7%~100%,与西藏毒株同源性范围为92.3%~96.7%,与国外毒株同源性范围为82.5%~98%;PPRV毒株P基因进化树分析显示该次疫情毒株同属一个分支,与印度毒株进化关系较近,与西藏毒株进化关系较远。通过分析发现,该次疫情可能由中国周边国家传入。     

云南省芒市猪圆环病毒感染的血清学与病原学监测

为了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染在云南省芒市的流行情况,试验从当地规模化猪场及散养户未接种PCV-2疫苗的猪群采集血清和组织样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和PCR方法分别检测血清抗体和病毒衣壳(N)蛋白基因片段(ORF2),并取PCR扩增阳性产物进行TA克隆、细菌转化和筛选培养,随后每个核酸样品随机挑取3个细菌克隆做DNA测序,最后应用DNAStar软件进行病毒DNA序列同源性比较和进化关系分析。结果表明:2013—2016年一季度、二季度、三季度、四季度猪群抗体阳性率分别为32.34%、53.53%、52.45%、40.22%,二季度抗体阳性率比较高。散养猪抗体阳性率略高于规模场猪群。病原学检测发现该市PCV-2的平均感染率达53.51%,且第三季度病原检出率高达77.42%,散养猪阳性率明显高于规模场;分析的8株毒株与河北株和广西株遗传距离较近,而与美国株和湖北株较远;当地流行毒株与PCV-2b基因型接近,并可分为明显不同的2个基因亚型。说明该市养殖猪群普遍存在PCV-2感染,其流行有明显的季节性和毒株基因型差异;结合当地引种情况,当地流行毒株可能来源于外省,建议引种时防范种猪携带PCV-2的风险,严格进行隔离和检疫。     

吉林省某羊群暴发小反刍兽疫

2014年3月底,从吉林省某羊群发生的临床以发热、流涎、口腔黏膜严重溃疡、呼吸困难、严重腹泻和高死亡率为特征的羔羊体内检测到130¹50nm的病毒粒子,该病毒命名为GZL-14毒株。应用RT-PCR从病羊体内扩增出小反刍兽疫病毒的基因序列。序列分析发现,GZL-14毒株N蛋白基因的核苷酸序列与国外分离株INDIA_1994和PRADESH_95的同源性最高,为99.3%,而与国内分离毒株China/Tib/07的同源性为99%;GZL-14毒株F蛋白基因的核苷酸序列与Izatnagar-94和Morocco-2008毒株的同源性最高,为98.1%,而与国内分离株China/Tib/07的同源性为97.2%,表明GZL-14株可能为新近由国外传入国内的毒株。本研究应用分子生物学手段,从病毒核酸水平首次确定吉林省某羊群新近发生的临床上以发热、流涎、口腔黏膜严重溃疡、呼吸困难、严重腹泻和高死亡率为特征的疫病为小反刍兽疫。     

实时荧光RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株和野毒株

为快速鉴别小反刍兽疫病毒的疫苗株和野毒株,本研究通过分析Gen Bank中已发布的小反刍兽疫病毒全基因组序列,设计了1对通用引物以及疫苗株和野毒株特异性探针各1条,建立了小反刍兽疫病毒鉴别实时荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对疫苗株和野毒株的检测灵敏度均可以检测至10拷贝/反应,在108至101拷贝/反应之间具有良好的线性关系,扩增效率均接近1。该方法具有良好的特异性,能够区分不同谱系的野毒株株和疫苗株。使用该方法对136份临床疑似样品检测,检出的阳性数量与普通RT-PCR相同,并且测序后的区分结果也相同。本方法的建立为该病的实验室鉴别检测和流行病学调查提供了技术支持。     

青海省海北州藏系绵羊种羊几种疫病的血清学调查

为了保证外调藏系种羊不感染疫病及无疫病病原传播,对筛选出的准备调运的藏系种羊进行疫病的血清学调查,试验分别采用布鲁氏菌试管凝集试验、小反刍兽疫病毒抗体直接竞争ELISA方法、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单克隆抗体阻断ELISA方法和口蹄疫O型液相阻断ELISA方法对藏系绵羊30份血清样品进行了布鲁氏菌、小反刍兽疫、口蹄疫自然感染和疫苗免疫的血清学抗体检测。结果表明:所有被检血清中均未检出布鲁氏菌和自然感染口蹄疫病毒抗体阳性血清。小反刍兽疫和口蹄疫疫苗免疫抗体水平检测显示,小反刍兽疫免疫抗体阳性血清30份,阳性率为100%;口蹄疫免疫抗体阳性血清28份、可疑血清1份、阴性血清1份,阳性率为93.33%,阳性血清免疫抗体效价均大于1∶128(保护率大于99.00%),可疑血清免疫抗体效价1∶90(保护率大于50.00%),阴性血清免疫抗体效价小于1∶2(不保护)。说明此次海北州筛选的藏系绵羊种羊未感染上述疫病,且疫苗免疫抗体效价水平较好,适合作为外调种羊。     

陕北白绒山羊小反刍兽疫病毒RT-PCR方法的建立

为了建立适用于本地区小反刍兽疫病毒的分子生物学快速检测方法,通过分析NCBI数据库中小反刍兽疫病毒N基因序列,根据该基因设计特异性引物,建立针对本地区小反刍兽疫病毒N基因的一步法RT-PCR检测方法,利用该方法对来自疫源地的不同病料样本进行检测,结果显示该方法对病料的可选择性较多,对检测到的阳性条带通过测序分析,发现流行毒株与陕西毒株基因型差异不明显。该检测方法的建立有利于开展小反刍兽疫疫情监测,为有效防控小反刍兽疫提供技术支撑。     

小反刍兽疫实验室诊断

为了对小反刍兽疫疑似病例进行实验室确诊,采集疑似小反刍兽疫病羊材料,用实时荧光定量RT-PCR检测方法以及一步法RT-PCR检测方法进行检测,并针对小反刍兽疫N基因序列设计引物扩增N基因并进行克隆测序及序列分析。试验结果可见,疑似小反刍兽疫病羊临床剖检表现为胃肠道及肺部出现坏死,肠道出现线状出血。实时荧光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法检测结果显示均为小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸阳性。N基因测序结果 China-GZ株与小反刍兽疫4个支系毒株序列比对显示,核苷酸同源性为89.0%~97.3%。本试验通过临床症状表现和实验室分子生物学诊断确诊该病例为小反刍兽疫病毒感染所致。     

2020—2022年玉溪市猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及遗传进化分析

为了解近年玉溪市猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行及遗传进化情况，本研究采集了2020—2022年间玉溪市4个养猪场的临床腹泻样品33份，采用RT-qPCR方法调查PEDV的流行情况，再用RT-PCR方法扩增PEDV阳性样品的M基因，分析病毒的遗传进化。流行病学调查结果显示，33份腹泻样品中，RT-qPCR检测PEDV阳性率为39.39%(13/33)。PCR扩增13份阳性cDNA样品M基因，测序结果证实为PEDV M基因片段。基于M基因遗传进化分析结果显示，玉溪市猪群流行的PEDV均属于基因2型，与其他代表毒株基因同源性为97.06%～99.56%,氨基酸同源性为96.48%～99.56%。结果表明，玉溪市PEDV以基因2型为主，提示需要选择更有效的疫苗来控制PEDV的流行。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株(ZJ16NB6)与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

江苏部分地区羊群边界病流行情况调查

本实验室从安徽某羊场发生腹泻的山羊病料中检测分离到边界病病毒（borderdiseasevirus,BDV）,证明BDV在我国羊群中存在。为了进一步了解BDV在江苏羊群的流行情况,本研究收集江苏部分地区发生腹泻和健康羊群的血清和组织样品,采用RT—PCR方法进行检测,并对阳性样品进行病毒的分离鉴定,测定分离毒株5’-UTR基因片段,与其他已报道的毒株进行同源性比较并绘制进化树。结果表明有27．4％（29／106）样品呈阳性,不N羊场BDV阳性率为0～67％,共分离到4株不同的BDV毒株,它们之间的同源性为73．9％～95．6％,而与其他BDV毒株的同源性为66．2％～91．6％。进化分析表明AH12-02与其他各毒株均较远,形成单独的分支,另3个毒株与BDV3型毒株关系最近。采用ELISA试剂盒对血清样品BDV抗体进行检测发现不同羊场抗体阳性率存在较大差异（0～100%）,还有抗体阴性持续感染个体的存在。以上结果丰富了我国BDV分子流行病学数据,为进一步探索BDV在我国羊群中的流行情况奠定了基础。     

应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒

为适应小反刍兽疫快速、准确、高通量诊断的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的小反刍兽疫病毒鉴定方法。对Gen Bank中已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析可以确定是否为小反刍兽疫病毒感染。采用所建立的PCR-焦磷酸测序方法对西藏采集的10份血清样品进行检测,检测结果表明,该方法可以用于小反刍兽疫病毒的检测,而且该样品可初步鉴定为疫苗株感染。     

小反刍兽疫病毒的N、M、F及H基因的序列测定和分析

小反刍兽疫病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属,为有囊膜的单股负链RNA病毒.以灭活的检测用抗原为材料,抽提基因组RNA作为模板,根据GenBank下载的序列及进行原核表达载体的要求,设计可扩增小反刍兽疫病毒N、M、F及H 4个基因的全长读码框(ORF)的引物,进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析.结果显示,均有预期大小的片段扩增出.扩增片段经核苷酸序列测定、分析,N、M、F及H基因ORF全长分别为1 578、1 008、1 641、1 830 nt; 4个基因均与疫苗株Nigeria 75/1(X74443)有100%的同源性,说明所购试剂盒用的检测抗原应该是用此疫苗株制备,也证明了设计用于原核表达的4对引物扩增片段的正确性.