AA肉种鸡内源性类ALV-J gp85基因及其抗原表位的分析

利用ALV-J gp85基因两侧的序列片段为引物,从山东潍坊某肉种鸡场送检的7日龄肉种鸡基因组中完整地扩增了内源性类ALV-J gp85基因。利用ALV-J env基因特异性引物不能扩增出长度为2.2kb的目的片段,用ALV-J特异性单抗JE-9做间接免疫荧光检测,也呈现阴性反应。这种内源性类ALV-J gp85基因与已报道的禽内源性反录病毒EAV-HP序列的同源性为85.6%～93.8%,其中与ADOL 0系来航鸡EAV-HP的相似性最高(93.8%)。所得到的内源性类ALV-J gp85基因与外源性ALV-J毒株HPRS-103、SD07LK1、NX0101的同源性分别为93.8%、91.8%和91.7%。并且与外源性ALV-J gp85基因具有相似的Jameson-Worlf抗原表位优势。这种内源性类gp85基因很可能与肉雏鸡早期感染ALV-J后所呈现的免疫耐受现象有关。     

J亚群白血病的病理学观察及基因分析

内蒙古某肉种鸡场40周龄种鸡发生肿瘤性疾病，死淘率15％；经病理组织学检查，增生的肿瘤为典型的髓细胞瘤，因此怀疑此病是J亚群白血病。取病鸡肝电镜观察，在肝细胞胞浆膜下见有圆形的类病毒粒子存在；将肝病料处理后接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)，经电镜观察，可见正出芽的病毒粒子。为进一步确诊，以ALV-J原型株HPRS-103囊膜gp85基因为基础设计特异性引物，以感染的CEF基因组DNA为模板，体外扩增(PCR)gp85基因，结果获得了924bp的相应片段。将PCR产物进行分子克隆和序列测定，结果表明，内蒙古地区ALV-Jgp85蛋白的推测氨基酸与ALV-J原型株HPRS-103、山东SD9901株、美国ADOL-R5-4株及内源性病毒EAV-HP的gp85蛋白的氨基酸同源性分别为97.40％、95.13％、86.69％和85.06％，其中与HPRS-103的同源性最高，与EAV-HP同源性最低。因此可以确定本研究所克隆的基因为ALV-Jgp85基因，暂命名为ALV-J-NM8761。     

不同地区海兰褐蛋鸡中J亚群-禽白血病病毒株gp85基因的分子演化分析

本研究通过对不同地区海兰褐蛋鸡群中分离的5株J亚群-禽白血病病毒(ALV-J)的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行同源性分析,阐述了不同海兰褐鸡群中存在的ALV-J的分子演化规律。对2008-2009年分别从北京、陕西、山东泰安、济阳、曲阜等不同地区饲养的海兰褐鸡分离到的5株ALV-J,用PCR方法克隆gp85基因、测序,并与国内外已发表的14株ALV-Jgp85基因进行同源性比较。结果表明,5株ALV-J与来自白羽肉鸡的HPRS-103株的同源性最近,平均为96.6%(96.4%～96.8%);与来自国内海兰灰蛋鸡的SD07LK1株的同源性平均仅为89.6%(89.3%～89.9%);而5株ALV-J间的同源性高达98.1%以上(98.1%～100%)。本研究发现,不同地区的海兰褐蛋鸡中广泛存在的ALV-J可能有一个共同的来源,即国外的白羽肉鸡。     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HLJ09MDJ-1株的分离鉴定

为了解蛋鸡中禽白血病当前流行毒株类型及其gp85基因分子特征,在临床症状和病理组织学观察的基础上,采用ELISA抗原检测、特异性PCR以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),证实从黑龙江省某鸡场送检蛋鸡中分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HLJ09 MDJ-1;克隆了其gp85基因,并进行了序列分析比较。结果表明,该分离株的gp85基因与国内外其他ALV-J毒株的核苷酸同源性为88.2%～98.2%。其中,HLJ09 MDJ-1与英国原型株HPRS-103的同源性最高(98.2%),与美国株ADOL-7501的同源性最低(88.2%),表明HLJ09 MDJ-1的gp85基因与HPRS-103有较近的亲缘关系。本研究从蛋鸡中分离到ALV-J毒株,为研究ALV-J宿主嗜性改变和ALV-J对蛋鸡致病机制提供了素材。     

我国部分地区蛋鸡ALV-J分离株gp85基因遗传进化分析

为了解我国蛋鸡J亚型白血病病毒(ALV-J)株来源及其遗传进化关系,本研究对2009年从我国6个省区蛋鸡场分离到的19株ALV-J的gp85基因进行克隆和测序,并与11个ALV-J参考株gp85基因作了比较分析.结果表明:19个ALV-J分离株的gp85基因长度为894bp～924 bp不等,分别编码298～308个氨基酸;各病毒株间gp85推导氨基酸的同源性为71.3%～100%.遗传进化分析表明,目前我国蛋鸡ALV-J分离株来源复杂,其中13个分离株与英国原型株HPRS-103、国内麻黄肉鸡株SCAU-0901亲缘关系较近;3个分离株与美国株ADOL-7501及国内白羽肉鸡株HN0001处在同一大的分支;而另外3个分离株则各自形成独立的分支,表明其gp85基因发生了较大变异.本研究表明,19个分离株与国内早期肉鸡分离株亲缘关系较远,提示我国当前蛋鸡ALV-J株可能并非源自国内早期肉鸡ALV-J株,其来源有待进一步研究.     

某海兰褐鸡场祖代、父母代及商品代鸡血管瘤型ALV-J的分离与鉴定

从山东省某海兰褐鸡场祖代、父母代种鸡和商品代蛋鸡中获得疑似血管瘤型禽白血病(Avian leukosis,AL)病料.采用病理剖检、IFA、分子生物学检测,确定为J亚群禽白血病.从祖代、父母代病料中各分离到1株J亚群禽白血病病毒(J subgroup of avian leukosis virus,ALV-J),从商品代蛋鸡中分离到4株ALV-J.根据原型毒株HPRS103设计1对gp85基因引物,获得gp85基因序列.获得的gp85基因序列与各亚群参考毒株序列核苷酸同源性比对,结果显示:分离自商品代蛋鸡的Commercial03株、Commercial04株、Commercial06株和父母代分离株Parent02株位于同一分支,同源性在97.2％～97.9％,与HPRS103株同源性94.7％～95.2％;Commercial05株与祖代分离株Grandparent01株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％～99.9％.表明商品代蛋鸡中的ALV-J可能来自父母代或祖代种鸡的垂直传播,也可能来自于其他来源的水平传播.从同一鸡场祖代、父母代及商品代鸡中分离得到ALV-J,这在我国还是首次.对后续研究其基因突变、致瘤机制等奠定了良好的基础.     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析

近两年我们从国内不同省份先后分离和鉴定了8株J亚群禽白血病病毒（ALV-J），并对其中的5株进行了gp37基因的克隆和序列分析，结果表明，我们分离的5株ALV-J之间的同源性为94.6%-99.0%；与国内最早分离的SD9901，SD9902和YZ9901等毒株之间的同源性分别为95.3%-98.5%,95.6%-99.0%和94.9%-98.6%；与国际最先报道的原型株HPRS-103之间的同源性为93.4%-95.1%；与其它国外毒株的同源性为92.7%-96.8%。这表明我国ALV-J的gp37基因正在不断发生变异，但相对于gp85基因的变异性要小。     

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）原型株HPRS-103基因组碱基#5394-#5416及#7811-#7794的1对引物对PCR，在2000-2001年从山东，河南和宁夏分离的8株ALV-J中，有6株可以扩增出含gp85基因的2.2kb左右的特异性片段，对其中5株的扩增片段做了序列分析，结果表明，这5个毒株的囊膜糖蛋白gp85与原型株hprs-103有93.4%-96.8%的同源性，与我国最早的分离株SD99024有93.7%-98.7%的同源性，它们相互之间的同源性为91.2%-98.7%，由此说明，我国AVL-J的gp85基因正在不断发生变异。     

血管瘤禽白血病病毒FJ0610株的分离与鉴定

为了解禽白血病病毒在商品蛋鸡中的流行情况,试验采用病理剖检、聚合酶链式反应(PCR)以及间接免疫荧光试验(IFA)等方法对送检的疑似禽白血病病毒感染的商品蛋鸡进行了病毒分离与鉴定,并对分离株的致瘤相关基因gp85基因进行测序,与国内外各亚群禽白血病病毒进行对比。结果表明:分离、鉴定到1株J亚群血管瘤禽白血病病毒,命名为FJ0610;分离株gp85基因核苷酸序列同源性在11.5%～94.5%之间,其中与血管瘤禽白血病毒株ZH-08株同源性最高,而与E亚群毒株同源性最低;基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明FJ0610株的gp85序列与ZH-08株的亲缘关系最近。     

Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosis virus.

In an attempt to develop a specific diagnostic test for avian leukosis virus (ALV) subgroup J (ALV-J) strain Hc1, four monoclonal antibodies (MAbs), JE9, G2, 145, and J47, were generated that are specific for ALV-J envelope glycoprotein, gp85. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify genomic pro-viral DNA of Avian Disease and Oncology Laboratory (ADOL)-Hc1 and ADOL-4817 envelope genes. Both open reading frames encoding glycoproteins gp85 and gp37 were cloned into baculoviruses. Abundant expression of gp85 and gp37 was detected in the recombinant viruses with specific antibody to Hc1 strain of the ALV-J. The expressed proteins were used for immunization of mice to produce hybridoma cell lines secreting MAbs specific to ALV-J envelope protein. A panel of MAbs was generated by fusing NS1 myeloma cells and spleen cells from mice immunized with the recombinant baculoviruses. With the use of an immunofluorescence assay, three MAbs (JE9, G2, 145) reacted with ALV-J but not with subgroups A, B, C, D, or E of ALV. MAb J47 reacted with all exogenous subgroups of ALV including A, B, C, D, and J but not with endogenous subgroup E viruses. Western blot analysis was performed with all four MAbs against recombinant baculovirus and Hc1-infected chicken embryo fibroblast (CEF) lysates. A major band with a molecular weight about 90 kD corresponding to the size of ALV-J envelope was consistently obtained. With these MAbs, we detected the Hc1 antigen in CEFs infected with several ALV-J viruses isolated in the United States and also in tissue sections from chickens infected with Hc1 strain of ALV-J. These MAbs will be useful reagents for the diagnosis of ALV-J infection because they recognize a common antigenic epitope in six isolates tested thus far.     

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT-PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindⅢ,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18-T-Hrb-1/env,对其进行Pst Ⅰ酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb-1 gp85基因的997bp片段,应用Bac to Bac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFast Bac HTA进行连接,获得重组载体pFAST BacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础.     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

J-亚群禽白血病JL-2株的分离鉴定

近年来，J-亚群禽自血病的暴发流行在国内时有报道，在本研究中，自吉林某患病鸡群分离出一株病毒，采用特异性引物，经RT-PCR扩增出长度为545bp的J-亚群禽自血病病毒特异性核苷酸片段；将病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖，获取其前病毒DNA，依据原型毒株RPRS-103 cDNA序列设计并合成一对引物，经PCR扩增得到包括gp85、gp37、E-element基因在内的近1．8kb的DNA片段，将其连到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌JM109，培养后提取质粒分别用Hind Ⅲ，BamHI进行单酶切和双酶切鉴定，得到了阳性重组质粒pMD18-T-JL2／env，核苷酸序列测定结果表明，该片段为J-亚群禽白血病病毒囊膜基因，其中亚型特异性片段gp85和标准对照毒株HPRS-103的同源率为94％，所编码氨基酸的同源率为87％。