不同分子质量丝素肽的形貌结构与止血性能

为了利用蚕丝开发天然医用止血材料,以Ca Cl2-乙醇-水三元体系在不同温度条件下水解丝素蛋白并经喷雾干燥制备丝素肽,通过凝胶色谱、红外光谱、扫描电子显微镜、高效液相色谱仪等观测丝素肽的分子质量分布、形貌结构以及氨基酸组成和含量,通过凝血弹性描记分析(TEG)、大鼠肝脏止血模型和体外细胞毒性实验评价丝素肽的止血性能及细胞相容性。丝素蛋白在48℃条件下水解24 h获得的丝素肽分子质量分布在12~76 k D范围,平均分子质量为30 k D;在98℃条件下水解24 h获得的丝素肽分子质量分布在3.9~32.0 k D范围,平均分子质量为12 k D。2种丝素肽的二级结构均以无规卷曲为主,平均分子质量为30 k D的丝素肽存在部分β-折叠结构,且在水中易形成凝胶,用于处理大鼠肝脏止血模型时的出血量少,止血时间短,止血效果优于平均分子质量为12 k D的丝素肽,与Arista止血粉相近,且无细胞毒性,有望开发为体外快速止血材料。     

Alcalase、Flavourzyme合用体外水解豆粕生产大豆肽混合物的参数研究

试验首先采用单因子设计研究了Alcalase(内切酶)单酶体外水解豆粕生产大豆肽混合物的适宜参数,结果表明:Alcalase水解豆粕的适宜条件为温度60℃,初始pH值7.9～9.0,反应时间4～6h,酶水平0.012～0.024AU/g豆粕;在单因素试验基础上,采用三因素二次回归正交组合试验设计研究了Alcalase、Flavourzyme联合使用水解豆粕的回归方程,结果为:Alcalase与Flavourzyme同时合用水解豆粕时,蛋白酶水平、水解时间与反应体系中TCA-NSI、NH2-N含量的二次回归方程是成立的。据此方程及生产实际成本,确定在温度50℃、未外加任何酸碱调节pH值条件下,适宜参数为:Alcalase0.006～0.021AU/g豆粕,Flavourzyme水平为2LAPU/g豆粕,反应时间6～10.5h,此时NH2-N含量8.807%～13.33%,TCA-NSI为31.66%～56.53%,平均肽链长集中在2～5个氨基酸残基。     

家蚕丝素蛋白的氨基酸组成与营养分析及酶消化产物的体外抗氧化活性

对家蚕丝素蛋白的氨基酸组成、食用营养价值,以及经酶处理的消化产物的体外抗氧化活性进行测试分析,为开发高附加值丝素蛋白产品提供理论依据。测定结果表明,甘氨酸和丙氨酸是丝素蛋白的主要组成部分,占总氨基酸质量的62.21%;丝素蛋白富含非极性氨基酸,占总氨基酸质量的69.08%。体外消化试验表明,丝素蛋白不易被胃蛋白酶消化,但易被肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。丝素蛋白的酶消化产物具有良好的体外清除DPPH自由基活性(IC50=151.6μg/m L)、螯合Fe2+能力(IC50=201.4μg/m L)和还原能力。以上结果提示:虽然丝素蛋白的氨基酸组成不均衡,食用营养价值低,但因其有极高的非极性氨基酸含量,是制备药用氨基酸和生物活性肽的理想原料。     

丝素膜表面接枝肝素分子的反应条件与体外抗凝血作用

利用等离子体处理技术使丝素膜表面被激活,以戊二醛作为交联剂,接枝肝素分子进行丝素膜表面抗凝血性修饰,从而为新型抗凝血生物医用材料的设计及临床应用提供试验依据。单因素优化实验结果显示:经等离子体和戊二醛处理后的丝素膜与肝素溶液的较好反应条件为pH 1.5、40℃、4 h,该条件下丝素膜表面肝素含量为37.62μg/g。经体外凝血试验检测,接枝肝素分子后的丝素膜具有较强的抗凝血活性;经稳定性试验分析,肝素与丝素膜结合稳定牢固不易被洗脱,提示其结合方式为共价键结合。     

林蛙皮生物活性肽3种提取方法的比较研究

为了高效提取林蛙皮生物活性肽,试验采用甲醇提取法、超声波提取法、超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法进行比较研究。结果表明:超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法的提取效果最好,提取条件为加入Alcalase蛋白酶1.5 g,酶解温度为40℃,酶解时间为4 h。     

多孔转基因丝素支架的制备及性能测试

以2种融合了蜘蛛丝蛋白的转基因蚕丝为材料制备转基因丝素支架,通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)及压缩测试等方法表征转基因丝素支架的结构与性能变化.结果 表明,转基因丝素支架的横截面以蜂窝状多孔结构为主,易于细胞的黏附和生长;再生丝素蛋白结构发生变化,β折叠结构含量提高了16.14％;力学性能得到改善,压缩模量和抗压强度分别提高了24.49％和38.11％.体外细胞培养验证了转基因支架材料生物相容性良好,对细胞增殖没有显著影响,是一种更理想的肌骨组织修复医用备选材料.研究证实了转基因蚕丝应用于再生丝素材料的可行性,为组织工程材料开发提供了新的方向.     

纳米TiO2/丝素蛋白多孔材料的结构和性能

将不同配比的纳米TiO2加入到丝素溶液中,经过冷冻干燥,得到纳米TiO2/丝素蛋白多孔材料。采用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、红外光谱(FTIR)对材料进行了表征及溶失率的测试,结果表明:纳米TiO2/丝素多孔材料的内部孔为不规则的多角形,且孔与孔相互贯通,平均孔径为22~68μm,孔隙率为85%~92%;随着纳米TiO2加入量的增大,丝素蛋白的结晶结构从silkⅠ向silkⅡ构象转变,在水中的溶失率明显下降。     

用酶水解结合盐溶解的方法制备丝素肽

以家蚕茧壳为原料,采用胰蛋白酶水解结合盐溶解的方法制备丝素肽。通过单因素试验、正交试验优化蚕丝蛋白纤维脱胶、酶水解、盐溶解和真空冷冻干燥全流程主要工艺条件为:蚕丝蛋白纤维以2.5 g/L Na2CO3+2.5 g/L NaHCO3的混合液脱胶30 min;在脱胶丝素蛋白纤维与8×105U/m L胰蛋白酶液的质量比为1∶100、酶解液pH 7.5、温度50℃的条件下酶解4 h;98℃下用200 g/L CaCl2溶液(浴比1∶120)溶解反应6 min;液态丝素肽在真空度60~70 k Pa条件下,进行-42℃3 h→60℃5 h→70℃4 h分段式真空冷冻干燥。在此工艺条件下,丝素蛋白的水解度为19.7%,获得的丝素肽样品呈粉末状,颜色洁白,无异味,可溶性指数接近100%,具有较好的商品性能与应用性能。     

采用吡啶三氧化硫制备硫酸化丝素及其抗凝血性能检测

硫酸化丝素是一种新型的蛋白基抗凝血医用材料。以丝素蛋白和吡啶三氧化硫为原料制备可溶性硫酸化丝素。对硫酸化处理不同时间获得的丝素蛋白样品进行红外光谱检测,结果表明用吡啶三氧化硫处理可溶性丝素蛋白2h以上可以将SO42-接枝到丝素蛋白上,当处理时间达到6h后含硫量达到最大值(1.26mmol/g)。将此硫酸化丝素配制成质量浓度为0.8mg/mL的溶液,其抗凝血效果能达到0.06mg/mL肝素钠的抗凝血水平,使血液在1h内不会凝固。该制备方法简单易行,得到的硫酸化丝素的抗凝血效果良好,有望进一步开发成为新型医用抗凝血材料。     

丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的制备及性能测试

为了改善丝素膜作为医用材料的物理性能,以丝素和纳米SiO2为基材,乙醇为溶剂,制备不同质量比的丝素/纳米SiO2凝胶共混膜。对丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的微观形态与结构进行表征:共混膜表面呈凹凸状,横截面为多层次的网络状结构,丝素蛋白分子主要为β-折叠结构。对不同质量比丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的物理性能进行测试:当丝素与纳米SiO2共混质量比为80∶5时,共混膜的断裂强度最大,为94.86 MPa;当共混质量比为80∶3时,共混膜的断裂伸长率最大,为55.20%;共混膜的溶胀度和热水溶失率与纳米SiO2含量成反比,而透气性随着纳米SiO2含量的增加呈先上升后下降的趋势。测试结果表明,在天然高分子材料丝素溶液中加入具有补强增韧功能的纳米SiO2制备的共混膜,更接近优良人工皮肤材料的物理性能特征,丝素与纳米SiO2的共混质量比以80∶3和80∶5为宜。     

家蚕蛹壳聚糖复合海绵止血材料的制备及止血性能测试

以从家蚕蛹壳中提取的壳聚糖为主要原料,与明胶共混溶解后加入助剂,通过冷冻真空干燥法制备海绵状复合止血材料。采用L16(45)正交试验,探讨复合止血材料中蚕蛹壳聚糖、明胶以及戊二醛、氯化钙和甘油等助剂的含量对体外凝血指数(BCI)的影响。各因素对BCI的影响大小顺序是:蚕蛹壳聚糖>氯化钙>戊二醛>明胶>甘油。优化复合止血材料中各组分的质量分数为:蚕蛹壳聚糖2.5%,明胶3.0%,戊二醛0.005%,氯化钙0.1%,甘油0.05%。对该复合止血材料进行体外凝血测试,并制作家兔耳动脉出血模型进行活体止血效果的试验,结果均表明其具有良好的止血效果,体外凝血指数较医用纱布和明胶海绵极显著下降,对缩短家兔耳动脉止血时间和降低出血量均极显著优于医用纱布和明胶海绵。     

纳米TiO2/丝素蛋白多孔膜的体外降解性能

为改善丝素蛋白膜的生物活性功能,通过冷冻干燥的方法制备了纳米TiO2/丝素蛋白多孔膜,并在人体模拟体液(simulated body fluid,SBF)中进行了体外降解试验。测试结果表明:纳米TiO2/丝素蛋白多孔膜具有较好的平均孔径和孔隙率,分别为22~53μm和86%~92%;降解20 d后,孔洞界限逐渐被破坏,复合多孔膜的失重率增大到35%以上;降解后多孔膜的结晶度有大于降解前的趋势;在多孔膜的内壁有羟基磷灰石的生成,具有很好的生物活性。据此认为,采用冷冻干燥法制备的纳米TiO2/丝素蛋白多孔膜,有望进一步开发成为软骨替代材料或创面涂敷材料。     

丝素蛋白/戊二醛对脆弱丝绸织物加固的工艺条件研究

采用丝素蛋白和交联剂戊二醛作为加固脆弱丝绸织物的材料,通过正交试验,研究了丝素蛋白和戊二醛的质量浓度、浸渍时间等因素对脆弱丝绸织物断裂强度、断裂伸长率、增重率、回潮率、色差、硬挺度等的影响,得出较优的加固处理工艺方案:丝素蛋白质量浓度为5 g/L,戊二醛质量浓度为0.05 g/L,在丝素蛋白溶液中的浸渍时间(t1)为40 min,戊二醛中的浸渍时间(t2)为60 min。在此工艺条件下,丝素蛋白/戊二醛对脆弱丝绸织物的加固效果明显,而且手感和外观较好。可利用该方法及工艺对丝绸文物进行加固保护。     

转基因蚕丝丝素膜的制备与性能表征

以转入蜘蛛丝蛋白基因的转基因家蚕的蚕丝为材料,用普通的流延成膜法即可将转基因蚕丝丝素溶液制备成丝素膜。以分别加入或未加入1%甘油的转基因蚕丝丝素膜和普通蚕丝丝素膜作为测试样品,通过傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)、X射线衍射光谱(XRD)及机械性能测试和扫描电子显微镜(SEM)观察等手段表征转基因蚕丝丝素膜的结构与性能变化。与含1%甘油的普通蚕丝丝素膜比较,含1%甘油的转基因蚕丝丝素膜仍旧含有较多的无规卷曲和α螺旋结构,膜的表面较为粗糙,水蒸气透过量增加了15%~20%,水中溶失率略有增加(为22%),应变增加了1倍左右(为38.5%),耐久性也更优(为164次±11次)。此外,转基因蚕丝丝素膜和普通蚕丝丝素膜与1%甘油共混后,膜的结构和性能均得到明显改善。研究结果表明,含蜘蛛丝蛋白的转基因蚕丝丝素膜的结构较松散,表面孔隙变大,力学性能改善,更具有作为生物医用材料应用的优势。     

多孔丝素凝胶的理化性状和生物相容性

以 10～ 10 0g/L不同浓度的丝素水溶液与二缩水甘油基乙醚反应得到平均孔径约 10 0～ 30 0 μm的多孔丝素凝胶 (CPFG)为材料 ,研究其理化性质和生物相容性。结果表明 ,CPFG的最大拉伸强度达 11g/mm2 ,伸度达 79% ,压缩回复率达 10 0 % ,吸水率达 15 0 0 %。CPFG在中性溶液中较稳定 ,很少有丝素蛋白质溶出 ,而胰蛋白酶对CPFG有分解性。成纤细胞表面培养显示CPFG有较好的生物相容性。     

丝素固定化木瓜蛋白酶填充床反应器及其应用研究

在研究丝素固定化木瓜蛋白酶的固定条件和酶学性质的基础上,研制了丝素固定化木瓜蛋白酶填充床反应器,用以降解酪蛋白,并研究了该反应器的实验条件、操作参数及对酪蛋白的降解能力。结果表明:在恒温30℃,恒定流速5.5mL/h,酪蛋白质量分数为0.5%的条件下,该填充床反应器的生产强度最高达1.42g/(L.h);产品转化率在2~13d内均能达到87.4%~99.9%;对酪蛋白的降解能力良好。     

家蚕丝素蛋白抗氧化肽的制备及其稳定性研究

利用碱性蛋白酶水解家蚕丝素蛋白制备抗氧化肽,考察水解pH、水解时间、加酶量、底物浓度、水解温度5个因素对水解产物DPPH自由基清除率的影响,在此基础上采用响应面试验优化水解工艺条件,并调查家蚕丝素蛋白抗氧化肽对热、酸、碱和体外肠道消化的稳定性,测定不同分子质量范围的家蚕丝素蛋白水解产物组分的抗氧化活性.结果 表明,碱性蛋白酶水解制备家蚕丝素蛋白抗氧化肽的最优工艺条件为水解pH 8.69、水解时间60 min、加酶量3035 U/g、底物(丝素蛋白)质量浓度26.80 g/L、水解温度53.89℃,在此条件下制备获得的家蚕丝素蛋白抗氧化肽对DPPH自由基的清除率为55.16％.家蚕丝素蛋白抗氧化肽具有良好的热稳定性;在中性环境中抗氧化活性很稳定,但在强酸和强碱环境中抗氧化活性明显降低;经体外模拟胃肠道消化后,对DPPH自由基的清除率比未消化处理对照组提高了9.43百分点.分子质量小于5 kD组分是家蚕丝素蛋白抗氧化肽的主要活性组分.研究结果为家蚕丝素蛋白功能产品的开发提供了试验依据.     

家蝇蛹的营养成分分析及抗氧化肽制备工艺研究

研究着力于分析家蝇蛹的成分,探索比较家蝇蛹抗氧化肽的制备方法,考察酶解法制备抗氧化肽的工艺条件。实验用水提醇沉法(WAM)、热变性法(TDM)和酶解法(EHM)制备得到家蝇蛹抗氧化肽,检测了三种方法制备产物的得率、应用OPA法测得多肽的含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳—银染法表征其分子量分布、比较抗氧化肽在五种体外抗氧化体系(ABTS自由基清除、DPPH自由基清除、羟基自由基清除、FRAP法测还原、亚铁离子螯合)中的抗氧化能力;最后通过单因素试验优化酶解法制备工艺。实验结果显示:水提醇沉法、热变性法和酶解法制备抗氧化肽的得率分别是(18.35±0.43)%、(25.11±0.49)%、(70.80±0.36)%;OPA法检测的多肽含量分别为(53.87±2.74)%、(43.33±1.07)%、(66.50±9.02)%;热变性法制备的抗氧化肽的自由基清除能力和还原能力均较强,酶解法制备抗氧化肽的亚铁离子螯合能力最优,而水提醇沉法的各项指标值均较低。单因素实验结果显示,最佳酶解条件为温度60℃、酶解时间30 min、加酶量6 000 U/g。以上结果提示,家蝇蛹营养成分丰富,酶解法和热变性法均能有效制得强抗氧化活性物质,具有开发成饲料或饲料添加剂的潜力。     

促细胞生长再生复合丝素蛋白电纺丝非织布的性能

利用家蚕丝素蛋白独特的力学和生物学特性,以电纺蚕丝纤维为载体,通过加入含有细胞粘附构型肽段(TGRGDSPAS)8的纯化细胞粘连性蛋白,改善丝素蛋白在促细胞生长方面的生物学功能。红外光谱检测表明,加入10%的细胞粘连性蛋白并不会明显影响丝素蛋白电纺丝的α-螺旋和β-构象,细胞培养试验中也表现出促进细胞增殖的作用,其活性细胞数目较单纯丝素蛋白纤维上的活性细胞增加,约为1.5×104cm-2,并对细胞形态没有影响。电镜扫描显示,以加入10%细胞粘连性蛋白后的电纺蚕丝纤维直径仍呈均匀分布状态。依据研究结果认为,以加入细胞粘连性蛋白的再生复合丝素蛋白电纺丝非织布纤维作为生物医学材料,具有更加良好的应用前景。     

吉他霉素纳米凝胶制备与评价

【目的】制备一种可局部递送吉他霉素用于皮肤创口感染的纳米凝胶。【方法】以京尼平为交联剂在希夫碱作用下,通过凝胶材料之间的静电作用制备壳聚糖/明胶/聚乙烯醇纳米凝胶,并载入药物吉他霉素,对其包封率、载药量、溶胀性能、纳米粒径、Zeta电位、微观结构扫描等表征结构及生物安全性进行测试,评估纳米凝胶的体外释放效果和伤口愈合活性。【结果】本研究制备的吉他霉素纳米凝胶,在其组方为每25 mL凝胶中含吉他霉素0.25 g、壳聚糖0.4 g、明胶0.3 g、聚乙烯醇0.2 g,京尼平0.2 g,其余量为去离子水时外观性状为淡蓝色纳米凝胶,无沉淀与药物析出,溶胀度高,载药量为13.6%,包封率为83.1%;扫描电镜下可见该纳米凝胶形成孔隙致密且分布均匀的三维网状结构;平均粒径为28.56 nm, Zeta电位为16.33 mV;生物安全性良好;纳米凝胶在体外释放药物可维持48 h,明显长于吉他霉素溶液的释放时间。此外,纳米凝胶还能使小鼠伤口缩小96%,有助于伤口愈合。【结论】本研究成功制备了吉他霉素纳米凝胶,通过体内体外试验评估证明了其潜在的药物控释与促进皮肤伤口愈合的能力。