CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。     

大肠杆菌免疫刺激DNA的克隆及其对抗体产生的影响

利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从大肠杆菌基因组中扩增免疫刺激基因，并把扩增的基因片段克隆和pGEM－T载体。PstI酶切结果表明重组质粒（rP）均含有扩增的基因片段；rP1与rP2是相同的重组质粒。利用酶联免疫吸附检测了重组质粒对小鼠产生抗体的影响，结果显示：重组质粒1与牛血清白蛋白（BSA），免疫小鼠能产生较同的抗体水平，而重组质粒3则对小鼠产生的BSA抗体水平没有影响。对重组质粒1的序列分析,克隆的基因片段中富含CpG序列，并含有数个具有强烈免疫刺激作用的RRCGYY（如：AACGTT）序列。本研究为基因免疫机理的深入研究和基因免疫佐剂的开发奠定了基础。     

DNA免疫防制鸡马立克氏病的初步研究

将MDVgB基因插入真核表达质粒pcDNA3 CMV启动子下游多克隆位点,构建成重组真核表达质粒pcDNA3-gB。将重组真核表达质粒分2组进行雏鸡腿部肌肉注射。雏鸡进行一免,2周后一组用重组真核表达质粒再加强免疫一次,另一组用构建的重组鸡痘病毒（rFPV）加强免疫。2周之后攻毒,观察免疫保护效果。2次用重组真核表达质粒免疫组的免疫保护率为75％;而先免疫重组表达质粒,后免疫rFPV组的免疫保护率仅为50％。结果表明,MDVgB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,但rFPV不能对其加强免疫。     

传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

本试验首先用ＰＣＲ方法扩增出ＩＬＴＶ ｇＢ基因,将其克隆到质粒ｐＵＣ１１９中,并进行了序列分析。将克隆的ｇＢ基因再亚克隆到禽痘病毒转移载体质粒中,然后,通过质脂体方法转染由禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）中,筛选蓝色的重组病毒,并对其进行了６轮蚀斑纯化。该重组病毒通过ＰＣＲ方法鉴定证明其基因组中含有完整的鸡传染性喉气管炎ｇＢ基因,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验证明了该重组鸡痘病毒表达了鸡传染性喉气管炎ｇＢ糖蛋白。     

伪狂犬病病毒gⅢ基因的克隆及其鉴定

以质粒ｐＵＣ１８和ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）为载体，克隆了伪狂犬病病毒Ｓ株基因组ＤＮＡ的ＰｓｔⅠ酶切４．３ｋｂ片段，该片段含有完整的ｐｒｖ４３基因和ｇⅢ糖蛋白基因。经酶切分析和对转化菌融合蛋白的免疫反应性及免疫原性分析，鉴定了重组质粒ｐＵＣ４．３和ｐＧｅ４．３，从而证实其插入片段含有完整的ｇⅢ糖蛋白基因。     

伪狂犬病病毒(PrV)糖蛋白gE基因在重组杆状病毒中的表达

应用ＰＣＲ方法扩增出１．８Ｋｂ的伪狂犬病毒糖蛋白ｇＥ基因,克隆到ｐＵＣ１１９中形成重组质粒ｐＲＺＥ。经测序鉴定后再将ｇＥ基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９２中,形成重组质粒ｐＶＬｇＥ。将ｐＶＬｇＥ与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得重组病毒ｒｐＶＬｇＥ。通过ＰＣＲ方法鉴定证明ｇＥ基因正确插入到杆状病毒基因组中,直接免疫荧光试验和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ结果表明ｇＥ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９昆虫细胞中获得高效表达。表达的ｇＥ蛋白将作为伪狂犬病强毒的ｇＥ基因缺失弱毒疫苗鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法的抗原,为进一步扑灭伪狂犬病发挥重要作用。     

猪白介素-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布及环境释放安全性

为了探讨pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒作为疫苗佐剂进入临床应用的生物安全性,本试验就pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布和环境释放安全性进行了研究.将pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒经肌肉途径免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间剖杀动物并摘取各种组织,抽提基因组DNA.利用PCR技术分析其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性,同时检测了免疫动物现场环境,以监测pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒上的猪IL-4基因、CMV启动子基因和抗性基因是否在环境细菌中发生转移和扩散.结果表明,免疫后1 d在3/3小鼠各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫后5 d仅有1/3小鼠于注射部位肌肉中存在重组表达质粒,免疫后15 d所有小鼠的各组织中无重组表达质粒存在;未发现pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中.因此,认为pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒对动物和环境是安全的.     

猪干扰素-γ哺乳动物细胞重组表达质粒作为疫苗佐剂在小鼠体内的组织分布及环境安全性研究

重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3．1／IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3．1／IFN-γ重组表达质粒经肌肉途径免疫小鼠,免疫后不同时间迫杀,并取各种组织抽提基因组DNA：一是利用PCR技术检测其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性;二是以PCR技术检测免疫动物现场环境样品,监测pcDNA3．1／IFN-γ重组表达质粒中的猪IFN-γ基因、CMV启动子基因和抗性基因是否转移和扩散到环境细菌中。结果表明,免疫24h后在小鼠的各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫5d后仅有1只小鼠注射部位肌肉和血液中存在重组表达质粒,免疫15d后所有动物的各组织中无重组表达质粒存在;同时未发现pcDNA3．1／IFN-γ重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3．1／IFN-γ重组表达质粒对动物和环境是安全的。     

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应     

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。     

新城疫病毒F基因的克隆表达及重组蛋白的反应原性分析

为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化入宿主菌Rosetta 2感受态细胞,在IPTG诱导下表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,NDV-F和NDV-Fm在原核系统中表达后分别获得了相对分子量为64.7 kD和48.7 kD的重组蛋白;重组蛋白能被抗NDV鸡阳性血清识别。试验表明,NDV-F和NDV-Fm可以在原核系统中表达,且具有良好的反应原性。     

细胞渗透肽TAT与3种弓形虫抗原的融合重组表达

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽反式转录激活因子(TAT)与3种弓形虫抗原和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的重组质粒,即pET28a-TAT-EGFP,pET28a-TAT-SAG1,pET28a-TAT-GRA4和pET28a-TAT-AMA1质粒。重组质粒被转化到大肠杆菌中并通过IPTG诱导,成功进行了融合表达,表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化,然后进行SDS-PAGE分析。结果得到31 ku的TAT-EGFP融合蛋白、34 ku的TAT-SAG1融合蛋白、38 ku的TAT-GRA4融合蛋白和62 ku的TAT-AMA1融合蛋白,经过Western blotting分析,感染弓形虫的小鼠血清可特异性地识别融合TAT的SAG1、GRA4蛋白和微弱地识别TAT-AMA1蛋白。     

含有分子内佐剂的CIC蛋白表达及免疫活性初步研究

为了研究含有分子内佐剂的CTB-IsdBid-Clfais（CIC）蛋白表达及其免疫活性,试验采用重叠PCR方法将分子内佐剂CTB与IsdBid-Clfais基因串联,并将CTB-IsdBid-Clfais（CIC）插入到表达载体pET-32a（+）中,构建pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中表达目的蛋白CIC,利用Western blotting方法对其进行鉴定,并以ELISA方法检测CIC蛋白的免疫活性。结果发现,试验成功扩增了2 072 bp的目的基因CIC,并将CIC正确连接到pET-32a（+）载体上,构建了pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒;Western blotting结果证实,该重组质粒能够在大肠杆菌BL21感受态细胞中正确表达CIC蛋白,分子质量大小为95.9 ku;ELISA结果显示,CIC试验组与IsdBid、Clfais蛋白组间均无显著差异（P>0.05）,与BSA组间差异极显著（P<0.01）。综上所述,本研究成功构建了pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,该质粒在大肠杆菌BL21中成功表达了CIC蛋白,且CIC能与IsdBid、Clfais免疫小鼠血清发生反应,具有较强的免疫活性。     

Study on Expression and Preliminary Immunocompetence of CIC Protein Containing Molecular Adjuvants

To express CTB-IsdBid-Clfais(CIC) protein and evaluate its immunogenicity, CTB (as a molecular adjuvant) could be tandem linked with IsdBid-Clfais gene by the overlapping PCR method, then CTB-IsdBid-Clfais(CIC) was inserted into pET-32a(+) vector to construct recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais. The recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais were transformed into Escherichia coli (E.coli) BL21 to express the CTB-IsdBid-Clfa(CIC) protein, the CIC expression protein and its immune activity were detected by Western blotting and ELISA,respectively. The results showed that the length of CIC gene were 2 072 bp, and CIC was correctly inserted into the pET-32a(+) plasmids, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed. Western blotting result confirmed that the molecular weight of CIC proteins was 95.9 ku, which were correctly expressed by E.coli BL21 with pET-32a (+)-CTB-IsdBid-Clfais plasmids. ELISA results showed that there was no significant difference among the CIC, IsdBid and Clfais protein groups (P>0.05), and there was extremely significant difference between CIC and BSA protein groups (P<0.01). In conclusion, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed, CIC proteins were correctly expressed, and were able to react with serum from mice immunized with IsdBid and Clfais,respectively,therefore, CIC proteins had strong immune activity.     

PPVVP2基因与PCV2ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

Cloning and comparison of heat-stable enterotoxin genes from Escherichia coli strains of bovine, porcine, and avian origins

The Ent plasmid encoding Escherichia coli heat-stable enterotoxin (ST) isolated from bovine, porcine, and avian strains were used for the cloning of ST genes. The ST+ DNA regions were finally cloned into pBR322 as the 1.75 kilobases PstI fragment. The electron microscopic analysis of self-annealed molecules indicated that ST+ recombinant plasmid had a stem-loop structure of a size the same as that observed in their wild type Ent plasmids. The stem-loop structures and the restriction enzyme cleavage mappings indicated that 4 kinds of ST genes cloned in this experiment may be identical to Tn1681. The ST production levels of the recombinant plasmids were higher than those of the original plasmids.     

CpG ODN重组质粒对猪外周血淋巴细胞免疫刺激作用的研究

为获得对猪具有免疫刺激活性的含CpG序列的重组质粒,设计合成了11条CpG序列,应用MTS比色法测定合成CpG ODNs刺激猪PBMC增殖的能力,结果有10条CpG ODN对猪PBMC具有刺激活性(SI>2);以对猪PBMC具有较高刺激活性的CpG06和CpG08为核心,分别合成含6次重复序列的重组质粒pCpG06和pCpG08,并检测其对猪PBMC的刺激活性,结果重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC的刺激指数分别可达4.97和5.32,并可刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4。研究获得的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性,可为猪用CpG佐剂的研究提供参考。     

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。     

VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽VP22与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-EGFP）,以及细胞渗透肽VP22与3种弓形虫抗原融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-SAG1、pcDNA-VP22-GRA4、pcDNA-VP22-AMA1）。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后,将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP转染COS7细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR检测,验证VP22-EGFP基因在COS7细胞中的表达情况。PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定结果显示所有重组质粒均构建正确。转染72 h后的细胞,在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光。RT-PCR扩增得到了大小为1 449 bp的目的条带,与预期结果一致。结果表明,重组质粒构建成功。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Chicken MHCⅠα and β2m Genes and Its Expression in 293T Cells

To explore the mechanism of MHCⅠ molecule in immune response,chicken MHCⅠα and β₂m genes were cloned by PCR.Then the fragments were inserted into the eukaryotic expression vector with fluorescent protein,and the recombinant plasmids pEGFP-MHCⅠα and pmCherry-MHCⅠβ₂m were constructed.The recombinant plasmids were transfected into 293T cell with lipofectin reagent.The gene products of recombinant plasmids were mainly located to endomembrane system of the cells by fluorescence microscopy,and changed the intracellular localization of the fusion with the fluorescent protein.Moreover,the positive reactions were observed by the method of Western blotting,and the proteins had the molecular weight of 68.3 and 41.3 ku,respectively,in accord with the target proteins.The results showed that the recombinant plasmids were expressed in 293T cells with a good immunological activity,and the proteins had the binding reaction with specific antibodies.