miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为确定miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的调节作用,试验选取泌乳期奶山羊乳腺上皮细胞为研究材料,利用脂质体转染技术抑制miR-142-3p的表达,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、试剂盒等检测miR-142-3p基因沉寂后其对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响。结果显示,miR-142-3p基因沉寂后,奶山羊乳腺上皮细胞增殖能力增强,β-酪蛋白及甘油三酯分泌增加。由此可知,miR-142-3p通过抑制靶基因作用,影响奶山羊乳腺上皮细胞增殖、分泌β-酪蛋白及甘油三酯等泌乳功能。     

雌激素受体基因在崂山奶山羊乳腺中的表达及其甲基化分析

实验利用Real-time PCR技术检测青春期、妊娠期、泌乳期及退化期崂山奶山羊乳腺组织中雌激素受体α基因的表达情况,通过亚硫酸盐测序法分析相应时期的甲基化水平,并分析二者之间的关系。结果表明:雌激素受体α(ERα)基因在青春期的崂山奶山羊乳腺中高度表达,妊娠早期表达量进一步上升,妊娠中期达到最高值,妊娠晚期表达量急剧下降,在此后的泌乳期及退化期表达量维持在较低水平;而甲基化检测结果显示,青春期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠晚期、泌乳早期、泌乳晚期及退化期ERα基因的甲基化比率分别为5.0%、3.8%、3.8%、0%、9.4%、10.6%、10.6%。结果显示,DNA甲基化与ERα基因的表达呈现滞后性的强负相关关系(P<0.01,γ=-0.982)。可见,崂山奶山羊乳腺组织中ERα基因的甲基化水平与基因表达之间有一定的关联。     

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成的影响

以体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞为模型,利用β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖/半乳糖检测试剂盒测定漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量;采用荧光定量RT-PCR检测β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖合成代谢相关酶和蛋白因子mRNA表达的变化。结果显示,25、50、100μg/ml的漏芦乙醇提取物以浓度依赖的方式显著提高乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量(P<0.05)及乳腺上皮细胞中乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的mRNA表达水平(P<0.05)。实验结果表明漏芦乙醇提取物能促进奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖,并能提高乳腺上皮细胞乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的基因表达,进而影响奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

褪黑素膜受体MT1与MT2在妊娠期奶山羊卵巢中表达特点

褪黑素(melatonin)是松果腺分泌的一种神经内分泌激素,主要通过其膜受体(MR)的介导参与调控动物生理节律、季节性繁殖和卵巢功能等生理过程。melatonin的高亲和性膜受体分为MT1和MT2两种亚型,本试验采用RT-qPCR和Western blot方法研究了MT1和MT2在妊娠期奶山羊卵巢中的表达特点。结果表明,MT1和MT2在妊娠不同阶段奶山羊卵巢中都有表达,并表现为相同的表达模式,妊娠中期表达水平最高,妊娠前期和妊娠中期表达水平极显著高于妊娠后期(P0.01)。MT1和MT2在不同妊娠期奶山羊卵巢中的表达特点与黄体的功能一致,提示褪黑素可能通过MT1和MT2的介导对妊娠期奶山羊黄体功能发挥调节作用。     

stat5高效表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前后stat5基因和蛋白的表达量、细胞活力及乳糖和酪蛋白分泌情况。结果表明,与空白细胞和空白载体组相比,非磷酸化STAT5蛋白和stat5基因的表达量增加(P<0.01),乳糖含量提高(P<0.05),细胞活力和增殖能力增强(P<0.01),酪蛋白和磷酸化STAT5(pSTAT5)表达增多(P<0.05)。结果提示,构建的载体pcDNA3.1+-stat5-αS1在乳腺上皮细胞中高效表达,显著提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。     

奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及β酪蛋白mRNA的表达

本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。     

褪黑素受体在未妊娠和妊娠牦牛子宫表达的研究

旨在研究褪黑素对妊娠牦牛子宫的调控作用,采用real-time PCR法和免疫组织化学S-P法,对未妊娠和妊娠不同时期牦牛子宫中褪黑素受体(MT1)mRNA和褪黑素受体(MT1)蛋白的表达进行研究。结果表明:牦牛未妊娠和妊娠的不同时期,牦牛子宫基质细胞(SC)和肌层平滑肌细胞(MM)中均有MT1蛋白表达(P0.05);血管内皮细胞(EBV)和血管平滑肌细胞(VSM)中的MT1蛋白表达,在妊娠28~35d差异不显著,随妊娠时间的增加,MT1蛋白表达增加(P0.05);腺上皮细胞(GE)中的MT1蛋白,在妊娠初期(妊娠28~35d)差异不显著,妊娠50~60d时,差异显著(P0.05),妊娠90~100d时,差异极显著(P0.01)。而在腔上皮细胞(SE)中,MT1蛋白表达量在妊娠28~35d比未妊娠时低(P0.05),而这种趋势随妊娠时间的增加继续降低(P0.01)。未妊娠牦牛子宫中MT1mRNA表达量显著高于妊娠牦牛(P0.01)。综上表明,在妊娠期,牦牛子宫对褪黑素的需求量降低,褪黑素主要作用于牦牛GE,调节子宫腺功能,使牦牛子宫产生适应妊娠的生理反应。     

不同浓度胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因表达的影响

应用Real-time PCR方法检测不同浓度(0、1、10和100 ng/mL)胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)处理后的体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因mRNA的相对表达量。结果表明,添加不同浓度IGF-Ⅰ对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ受体基因(IGFIR)、IGF-Ⅰ结合蛋白-3基因(IGFBP3)、α-s1-酪蛋白基因(CSN1S1)和κ-酪蛋白基因(CSN3)mRNA的相对表达丰度均无显著影响(P>0.05)。随着IGF-Ⅰ添加浓度的增加,β-酪蛋白基因(CSN2)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACACA)、脂肪酸合成酶基因(FASN)和脂肪酸结合蛋白-3基因(FABP3)mRNA的相对表达丰度显著上调(P<0.05)。提示,IGF-Ⅰ作为一种重要细胞因子参与调节乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪相关基因mRNA的表达。     

褪黑素受体MT1和MT2在绵羊胃中的分布及表达

【目的】应用分子生物学技术探究绵羊不同胃室组织褪黑素(MT)特异性膜受体MT1和MT2的分布规律及表达模式,以初步探明绵羊不同胃室组织褪黑素调节胃消化的生物效应机制。【方法】采集绵羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃5个组织部位,用ELISA、实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blotting方法检测褪黑素特异性膜受体MT1和MT2在绵羊胃组织不同部位的分布规律及表达模式。【结果】ELISA结果显示,绵羊各胃组织中均含有褪黑素,且皱胃中褪黑素含量最高,瓣胃次之,瘤胃背囊、瘤胃腹囊和网胃中均较低。实时荧光定量PCR结果显示,MT1和MT2基因mRNA在皱胃中含量均最高,其次是瘤胃腹囊,在瘤胃背囊和网胃中含量较低。免疫组化结果显示,MT1和MT2蛋白在绵羊各胃组织中均有分布,主要表达于各胃组织的黏膜层,且在皱胃腺体中的分布呈从底部到颈部逐渐增多的趋势。Western blotting结果显示,MT1和MT2蛋白在网胃中表达均最高,瓣胃次之,在瘤胃背囊、瘤胃腹囊和皱胃中表达均较低。【结论】褪黑素在绵羊各胃组织中差异化表达从而发挥多样性生理功能,可能通过与胃组织上特异性受体MT1和MT2结合,通过信号传导系统而调控前胃受食糜刺激后发生反刍生理过程。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式,进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程,本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化;在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸,采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响;采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路,使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示,在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期(P0.05,P0.01);在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平(P0.01);亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路(P0.05),而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达(P0.05,P0.01),进而极显著抑制β-Casein的合成(P0.01)。以上研究结果表明,4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关,亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达,进而影响乳蛋白的合成。     

颈静脉灌注精氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能和牛乳酪蛋白合成的影响

本文旨在研究颈静脉灌注精氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能和牛乳酪蛋白合成的影响。将6头体重、胎次、泌乳期、泌乳量和体况基本一致的荷斯坦奶牛随机分为3组(每组2头):酪蛋白模式组(对照组)、精氨酸灌注组、丙氨酸等氮组(与精氨酸灌注组等氮),采用3×3复拉丁方试验设计,每期22 d(7 d灌注期+15 d间隔期),测定其泌乳性能、酪蛋白含量以及酪蛋白基因的表达情况。结果表明:1)灌注的第5天精氨酸灌注组的乳蛋白及乳中非脂固形物含量均显著高于酪蛋白模式组(P0.05);第6天精氨酸灌注组的乳脂率显著高于丙氨酸等氮组(P0.05)。2)酪蛋白模式组的α-酪蛋白含量显著低于其他2组(P0.05);β-酪蛋白含量在3组间没有显著的差异(P0.05);κ-酪蛋白含量则以精氨酸灌注组为最高,显著高于其他2组(P0.05)。3)精氨酸灌注组αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、αs2-酪蛋白基因(CSN1S2)的表达量显著高于其他2组(P0.05)。综上,灌注精氨酸提高了乳蛋白中α-酪蛋白和κ-酪蛋白含量,以及CSN1S1、CSN1S2在奶牛乳腺组织的表达量,有利于牛乳中乳蛋白率和乳品质的提高。     

绵羊附睾褪黑素受体1的表达与定位

为研究褪黑素受体1(MT1)在不同年龄绵羊附睾中的表达模式,选用幼龄绵羊(2~3月龄)、青年绵羊(6~8月龄)和成年绵羊(2~3岁)的附睾,采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测不同年龄绵羊附睾各部位MT1基因mRNA的表达量和MT1的分布情况。结果表明:幼龄绵羊附睾尾MT1基因的转录水平极显著高于附睾头和附睾体(P0.01);青年绵羊附睾体和附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头(P0.05);成年绵羊附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头和附睾体(P0.05),附睾各部位MT1基因的转录水平随年龄增长呈明显降低趋势;定位结果显示,MT1在各年龄组绵羊附睾的各个部位均有分布,且主要分布在附睾上皮细胞中。综合上述结果,不同年龄绵羊附睾的不同部位均有MT1表达和分布,并随年龄增长各部位的表达量降低,相同年龄绵羊附睾尾MT1的表达水平较高。     

人血清白蛋白基因乳腺表达载体在奶山羊乳腺中的瞬间表达

构建了包括人血清白蛋白 ( h ALB)基因的 c DNA全序列、内含子 1以及山羊β-酪蛋白基因启动子和 5′端上游调控序列在内的乳腺表达载体 pc DNA3.1 -GCALBm,采用直接注射法将其导入哺乳期的奶山羊乳腺组织 ,然后通过放射免疫法测定乳汁中 h ALB的含量。结果显示 ,5头受试奶山羊的乳汁中有明显的 h ALB表达 ,注射后第 2天放免测定值从注射前的 4 .0 mg/L左右分别上升至 62 .2、59.2、36.2、4 2 .3、1 7.5mg/L,并持续表达在 2周以上 ,其中 1头受试羊乳汁中 h ALB的表达量维持在 80 mg/L左右 ,并超过了 1 0 0 d。而在乳腺组织中注射 pc DNA3.1空质粒或生理盐水的 4头对照奶山羊的乳汁中 ,放免测定值无变化。     

FMDV2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达.克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EGFP基因的表达.重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白.结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达.     

催乳素刺激牛乳腺中脂肪生成基因的表达但不刺激葡萄糖转运蛋白的表达

在泌乳开始时,葡萄糖转运蛋白(GLUT)和参与乳脂合成的一些酶的表达呈显著增加,本试验旨在研究催乳素是否刺激这些基因的表达。试验分为:无激素(对照组)、胰岛素样生长因子Ⅰ组、胰岛素(Ins)组、胰岛素+氢化可的松+羊催乳素(InsHPrl)组、胰岛素+氢化可的松+催乳素+17β-雌二醇(InsHPrlE)组,牛乳腺组织培养采用激素处理48、72和96h。试验采用实时荧光定量PCR检测β-酪蛋白、α-乳清蛋白和甾醇调节元件结合因子1(SREBF1)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰基辅酶A羧化酶(ACACA)、stearyol-CoA去饱和酶(SCD)、葡萄糖转运蛋白1、葡萄糖转运蛋白8和葡萄糖转运蛋白12的相对表达量。结果表明,催乳素混合组InsHPrl和InsHPrlE处理96h后,乳腺组织块中β-酪蛋白和α-乳清蛋白mRNA的表达增加了数百倍,同时也极显著提高了SREBF1、FASN、ACACA和SCD基因的表达(P<0.01)。然而,InsHPrl和InsHPrlE处理72h后,GLUT1或GLUT8表达量无明显变化,而GLUT12表达量显著降低了50%(P<0.05)。单一催乳素刺激组的小鼠乳腺上皮细胞系HC11或牛原代培养乳腺上皮细胞中,GLUTs表达不增加。此外,在催乳素刺激的奶牛乳腺中,GLUTs表达也无明显变化。说明在泌乳开始时,催乳素明显的增加了乳蛋白和脂肪生成基因的表达,但并没有显著上调GLUT基因的表达。     

L型氨基酸转运载体1对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的影响

为研究L型氨基酸转运载体1(L type amino acid transporter 1,LAT1)对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加(P0.01),β-酪蛋白的表达显著升高(P0.05),4F2hc表达变化不显著(P0.05)。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。     

三维模式下培养时间对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响

本试验旨在研究三维模式下培养时间对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)酪蛋白基因表达的影响。采用3头健康的3～5岁泌乳黑白花奶牛的乳腺组织,将BMECs经1代纯化后进行三维培养,在三维模式下分别培养3、5、7、9 d,测定BMECs中αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表达量。结果表明,利用三维模式培养5 d的BMECsαs1-酪蛋白和κ-酪蛋白基因表达量极显著高于培养3、7、9 d(P<0.01);利用三维模式培养5 d的BMECsβ-酪蛋白的基因表达量极显著高于培养3、7 d(P<0.01),高于培养9 d,但差异不显著(P>0.05)。结果显示,三维模式下培养时间影响BMECs中αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表达量,本试验条件下最佳培养时间为5 d。     

奶山羊USF1基因的克隆与组织表达分析

为了获得奶山羊(Capra hircus)USF1基因序列并分析其在不同泌乳时期乳腺组织中的表达规律,从奶山羊乳腺组织中克隆得到USF1基因序列(Gen Bank登录号:MF953285),CDS区序列933 bp,编码310个氨基酸。通过序列比对发现,山羊与牛(Bos taurus)、猪(Sus scrofa)和人(Homo sapiens)的USF1基因核苷酸和氨基酸序列相似性均较高,为94%以上。蛋白质结构预测发现,USF1蛋白质结构为典型的螺旋-环-螺旋结构;其蛋白不含跨膜结构域,亚细胞定位在细胞核内。实时荧光定量PCR分析表明,USF1基因在奶山羊泌乳前期、盛期和中期的乳腺组织中m RNA表达量均显著高于干奶期(P0.05)。因此,USF1可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程。该研究可为进一步揭示USF1基因在奶山羊乳腺组织中的功能及对脂质代谢的调控作用提供基础资料。     

抑制miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

【目的】探索miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞(chemical induced mammary epithelial cells, CiMECs)体外泌乳功能的调节作用,旨在为促进转基因乳腺生物反应器的发展以及“培养皿奶”的商业化生产奠定基础和提供新的思路。【方法】选取奶山羊耳缘成纤维细胞(GEFs)为研究材料,经单一小分子化合物TGFβR-1/ALK5的抑制剂(RepSox)诱导8 d后,分别从细胞的形态变化、特异性标记物免疫荧光染色以及油红O染色对其进行鉴定。之后运用脂质体转染技术在诱导成功的奶山羊CiMECs中分别转染miR-142-3p的抑制物(miR-142-3p inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞作为空白对照(BC),转染24 h后,采用实时荧光定量PCR检测miR-142-3p的表达水平,CCK-8法检测细胞的增殖率,Western blotting检测β-酪蛋白(β-casein)的表达量,甘油三酯酶法测定甘油三酯的含量。【结果】GEFs诱导8 d后形成岛屿状多核仁样的上皮样聚集;免疫荧光染色结果显示,诱导后的GE...     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.