猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗免疫猪脾脏转移因子的制备及其活性分析

从猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗免疫猪脾制备转移因子(TF),检测其免疫活性,为开发新型免疫增强剂和有效防制PRRS提供科学依据。用PRRSV弱毒活疫苗免疫健康育成猪,无菌采集脾,通过透析法从脾提取TF。应用磺基水杨酸法、茚三酮反应和硝酸-钼酸铵试验等方法检测TF的主要成分,经高效液相色谱法测定TF中氨基酸种类及其含量;通过鸡红细胞吞噬试验和MTT法,检测TF对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血淋巴细胞增殖活性的调节作用。进而将9头4周龄健康仔猪随机分为A、B和C组,每组3头。A组每头猪左、右侧耳后分别肌内注射1头份PRRSV疫苗和1mL TF;B组每头猪注射1头份PRRSV疫苗与1mL TF的混合液;C组每头猪注射1头份PRRSV疫苗与1mL生理盐水混合液。免疫后20d,通过MTT法检测每组猪外周血淋巴细胞(PBLC)的增殖活性。制备的TF内无蛋白质成分,含有核酸和18种氨基酸,每毫升TF含核酸21.5μg、总氨基酸3.479mg。TF能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力和PBLC增殖活性。当TF与PRRSV疫苗分开或混合注射给4周龄仔猪后,能够显著提高仔猪PBLC的增殖能力。从PRRS弱毒活疫苗免疫猪的脾制备了TF,其能显著提高巨噬细胞的吞噬功能和外周血淋巴细胞的增殖活性。     

兽用鸡脾转移因子的多肽组成研究

为了研究兽用鸡脾转移因子的多肽组成,利用冻融一透析法制备兽用鸡脾转移因子溶液,分别采用福林酚法测定多肽含量,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法（MALDI—TOF-MS）测定分子量,液相色谱-质谱联用法（LC—MS）分析多肽组成,脱E受体法测定转移因子活力。鸡脾转移因子溶液多肽含量为1570．8μg／mL．活力为10．92％,LC—MS法测得多肽分子量为800～7476Da,多肽种类581种,包括T细胞凋亡抑制相关蛋白（TIALl）等多种生物活性蛋白。初步揭示了兽用鸡脾转移因子的多肽组成。有助于进一步研究其有效成分和作用机理。     

鸡和猪脾转移因子活性组分的提取及免疫活性研究

采用Sephadex G-25柱层析法分离提取鸡、猪脾转移因子(Transfer Factor,TF)各组分。利用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型,通过MTT法比较鸡脾TF各组分及TF原液对免疫抑制小鼠和正常小鼠的淋巴细胞转化的作用,同时比较了不同来源的鸡脾和猪脾TF各组分及原液对正常小鼠淋巴细胞转化的作用。结果表明鸡脾和猪脾TF均由三大组分构成,其中鸡脾TF三大组分及原液均对免疫抑制小鼠的外周血淋巴细胞转化具有明显的免疫增强作用,与对照组相比均表现差异显著(P<0.01),其中组分Ⅲ的淋巴细胞转化最佳,组分Ⅰ与组分Ⅱ接近,但均优于原液。而对正常小鼠的外周血淋巴细胞转化却表现不同的结果,其中组分Ⅰ和原液具有显著的免疫增强作用(P<0.05),组分Ⅱ作用不显著,组分Ⅲ则起到极显著的抑制作用(P<0.01)。而不同来源的猪脾和鸡脾TF各组分及原液对正常小鼠的淋巴细胞均表现出一致的免疫活性。     

猪脾转移因子对雏鸡免疫应答的作用研究

将猪脾转移因子(Transfer Factor,TF)与鸡新城疫疫苗配合应用,比较猪脾转移因子对人工接种新城疫疫苗的鸡淋巴细胞转化率和新城疫HI效价的影响。结果表明,应用TF试验组的淋巴细胞转化率和血清抗体效价与单独接种疫苗对照组相比较,差异显著,说明TF与疫苗配合应用时具有协同作用,可显著地提高机体的细胞免疫和体液免疫功能,增强疫苗的免疫效果。     

与猪PD-1和PD-L1互作表位多肽的筛选及其免疫调节功能

本试验旨在筛选和鉴定与猪程序性死亡因子1(PD-1)及其配体(PD-L1)相互作用的表位多肽，为阻断猪PD-1/PD-Ls通路逆转机体的免疫功能提供新策略。根据已解析人与鼠的PD-1与PD-L1相互作用的关键氨基酸位点信息，分析猪PD-1与PD-L1蛋白相互结合的关键氨基酸位点，在关键氨基酸位点处设计系列表位多肽，固相合成法合成表位多肽；分离自然感染猪圆环病毒2型(PCV2)仔猪的外周血单个核细胞(PBMC),检测表位多肽与猪重组蛋白PD-1、PD-L1和PBMC的结合能力，选取能结合猪PD-L1和PBMC的表位多肽pPD-15,检测其对猪PBMC增殖的影响，分析其作为佐剂免疫后对小鼠猪瘟病毒(CSFV)抗体水平的影响，最后，高效液质联用色谱法(HPLC-MS)检测表位多肽pPD-15的纯度和氨基酸序列正确性。结果显示，表位多肽pPD-15能结合猪PD-L1和PBMC;增殖试验显示，pPD-15组M1的平均荧光强度(74.20%)比空白对照组M1的平均荧光强度(4.37%)提高了69.83%,表明表位多肽pPD-15可促进猪PBMC的增殖；动物免疫试验显示，pPD-15作为佐剂可以提高...     

猪脾转移因子的鸡临床安全性和有效性试验

为明确猪脾转移因子（TF）的鸡临床安全性和有效性，采用自制的3批猪脾TF，分别以0.1和1.0 mL剂量肌内注射1、14日龄肉种鸡和1、7、14、21日龄肉鸡，以0.2和1.0 mL剂量肌内注射8、26周龄肉种鸡，并设立不注射对照组，共有9 800羽鸡用于临床安全性试验；将3批猪脾TF以0.1 mL剂量分别与1.0羽份新城疫病毒（NDV）活疫苗（La Sota株）联合免疫1、14日龄肉种鸡和1、7、14、21日龄肉鸡，以0.2 mL剂量分别与1.0羽份NDV活疫苗（La Sota株）联合免疫8、26周龄肉种鸡，并设立单独免疫对照组，共有6 078羽鸡用于临床有效性试验，采用血凝抑制（HI）试验和淋巴细胞增殖试验，分别测定NDV HI抗体和淋巴细胞刺激指数（SI）。安全性试验结果显示，鸡群肌内注射TF后无应激反应，其精神状况、采食、饮水、粪便、注射部位反应情况均正常，剖检均未发现组织、器官病变，死淘率不高于对照组鸡群，肉种鸡产蛋情况正常；有效性试验结果显示，免疫后14、21 d联合免疫组NDV HI抗体滴度和淋巴细胞SI分别比单独免疫组提高了1.1~1.7、0.243~0.632，差异均显著（P＜0.05）。结果表明，猪脾TF对临床肉种鸡群和肉鸡群安全，并且具有增强临床鸡群免疫功能的作用。本研究为TF的临床应用提供了数据支持。     

鸡脾转移因子对肉鸡免疫应答及防病效果的研究

以肉鸡脾为原料，采用超滤法制备鸡脾转移因子（Transferfactor，TF）。单独使用鸡脾TF以及与疫苗联合使用，比较不同剂量、不同使用时间对肉鸡平均日增重、死亡率、淋巴细胞比率、免疫器官指数、巨噬细胞吞噬指数的影响。结果显示，当鸡群处于健康状况时，使用鸡脾TF对试验结果影响不大，但当鸡群处于非健康状态时，使用鸡脾TF可以改善免疫应答指标，明显提高鸡群的抗病力和日增重。疫苗加TF组与单用疫苗组相比，差异不显著（P〉0．05），但在降低死亡率和促进鸡增重以及提高巨噬细胞吞噬功能方面，疫苗组与对照组差异显著（P〈0．05），疫苗加TF组与对照组差异极显著（P〈0．01）。处于亚健康状态的鸡群使用鸡脾TF可提高机体抗病力，可与疫苗免疫同时使用，临床饮水使用的最佳剂量为0．5mL／只。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性分析

为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。     

蛋白质在猪体内的营养特点及其营养价值的提高方法

<正>在养猪生产中，饲料的费用占养猪费用的60%～80%，而蛋白质饲料又是猪饲料中价格高、用量大的原料，所以从猪机体本身、饲料生产以及饲养管理各个方面综合提高蛋白质的利用率，对养猪业的发展具有重要的意义。1蛋白质在猪体内的消化吸收1.1蛋白质在猪体内的消化作为单胃动物的猪，其蛋白质的消化起始于胃，首先盐酸使天然蛋白质变性，接着在胃蛋白酶、十二指肠胰蛋白酶和糜蛋白酶等内切酶的作用下，蛋白质分子降解为含氨基酸数目不等的各种多肽。随后，多肽经胰腺分泌的羧基肽酶和氨基肽酶等外切酶的作用，进一步降解为游离氨基酸(占食入蛋白质的60%以上)和寡肽。     

鸡刺鼠相关蛋白多肽抗体的制备与鉴定

制备鸡刺鼠相关蛋白(agouti-related protein,AgRP)多肽抗体并鉴定。根据GenBank中报道的AgRP一级结构信息,用TMHMM 2.0和DNA Star软件分析其蛋白跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性等,设计出1段13个氨基酸的多肽。将合成后的多肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,用与BSA偶联的AgRP多肽免疫新西兰大白兔,获取血清后亲和纯化出抗AgRP多肽抗体。通过ELISA法检测效价,Western blot和免疫组化法检测抗体特异性。结果获得了高效价的鸡AgRP多肽抗体,ELISA法测定其效价可达到1∶128 000,并可用于免疫组化研究。     

猪脾转移因子的部分生化和免疫性及其应用

对６只新生仔猪和８只成年猪脾脏提取的转移因子（ＴＦ）分析表明，新生仔猪已有较高含量ＴＦ（４．０１ｍｇ／ｇ），１７种氨基酸百分比与成年猪类似。通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的研究表明：新生仔猪脾ＴＦ已具有明显的免疫活性，但不及成年猪。给初生仔猪注射成年猪转移因子的试验表明，注射ＴＦ对白细胞数（ＷＢＣ），３日龄淋巴细胞增殖均无明显影响，但对４５日龄淋巴细胞有促进作用，对３０日龄至６０日龄增重亦有极     

Epitope mapping of Campylobacter jejuni flagellar capping protein (FliD) by chicken (Gallus gallus domesticus) sera

Campylobacter jejuni, a Gram-negative rod, is a zoonotic pathogen associated with human acute bacterial gastroenteritis worldwide. The flagellum, composed of more than 35 proteins, is responsible for colonization of C. jejuni in the host gastrointestinal tract as well as inducing protective antibodies against the homologous serotype. In our previous study, we demonstrated that the flagellar capping protein (FliD) is an immunodominant protein that reacted strongly to sera from field chickens. In this communication, we mapped linear immunoreactive epitopes on FliD using a set of 158 synthetic peptides of 15-mer overlapping with 11 amino acid residues on peptide microarrays with sera from field chickens. The results from peptide microarrays showed (1) no cross-reactivity of the immobilized peptides with the secondary anti-chicken antibody in the control incubation, and (2) heterogeneous patterns of sera reacting to the immobilized peptides. The peptides that reacted to more than three chicken sera and had higher averages of fluorescence units were selected for further validation by the peptide ELISA. The results showed peptides 24, 91 and 92 had relatively high reactivity and less variation among 64 individual serum samples, indicating these peptides represented the shared immunodominant epitopes on the C. jejuni FliD protein. These peptides were also recognized by sera from chickens immunized with the purified recombinant FliD protein. The findings of the specific shared linear immunodominant epitopes on FliD in this study provide a rationale for further evaluation to determine their utility as epitope vaccines covering multiple serotypes for chicken immunization, and subsequently, for providing safer poultry products for human consumption.     

罗曼鸡胚脾细胞白介素-18基因的克隆与序列分析

根据国外已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18) c DNA基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR技术 ,从鸡新城疫 系病毒接种 4 8h左右的罗曼鸡胚脾细胞中扩增出鸡 IL - 18全基因 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增片段全长 5 94 bp,共编码 198个氨基酸的前体蛋白 ,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡 IL - 18全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 10 0 % ;序列中编码成熟蛋白的这段基因与国内报道的源自白来航鸡编码 IL- 18成熟蛋白的基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 99.4 %。本研究为鸡 IL - 18的扩增及其他细胞因子的扩增提供了一种简便易行的新方法 ,为进一步研究IL- 18基因的结构、功能、表达及表达产物的应用奠定了良好基础     

Characterization of peptides in ensiled alfalfa treated with different chemical additives

Effects of different chemical additives on peptide composition in ensiled alfalfa (Medicago sativa L.) were investigated by using gel filtration and determination of N characteristics. The alfalfa silages were prepared untreated (control) or with formic acid, formaldehyde or tannic acid as additives at ensiling. All additives reduced non‐protein N (NPN), ammonia nitrogen (NH₃‐N) and amino acid N (AA‐N) in the ensiled forage, and the most effective reduction of NPN and AA‐N was observed in the formaldehyde‐treated silages. Peptides in the control silage were mainly dipeptides to peptides with five amino acid residues. Most peptides in the formic acid‐treated silage contained 4–12 amino acid residues. Although most peptides in the formaldehyde‐treated silages contained 4–6 amino acid residues, there was a considerable proportion of peptides with 7–11 amino acid residues. Tannic acid had little effect on peptide size of ensiled alfalfa extract in which most peptides contained 5–6 amino acid residues. Peptide size in formic acid‐treated alfalfa silage was greater than that in the other treatments. Addition of formic acid and formaldehyde not only increased the peptide concentration in alfalfa silage, but enlarged the peptide size.     

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR 技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy 质粒中,重组质粒用PCR 扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比,同源性分别为77.68%～97.28%和71.82%～98.18%,显示了很强的保守性;小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异,氨基酸序列23～36存在高变异区。     

Identification of an antihypertensive peptide derived from chicken bone extract

A novel angiotensin‐converting enzyme (ACE) inhibitory peptide was isolated and purified from chicken bone extract by enzymatic digestion. The peptide was defined as an ACE inhibitor, and it demonstrated antihypertensive activity following oral administration to spontaneously hypertensive rats (SHRs). The results of this study suggest that peptides derived from an extract of chicken bones, administered orally, have the ability to reduce the blood pressure of SHRs significantly over a short period of time (3 h). Moreover, the blood pressure then remains low for 3 h. This peptide derived from chicken bones may therefore have great value as a short‐term remedy for chronic conditions such as high blood pressure. The amino acid sequence of the peptide was YYRA (Tyr‐Tyr‐Arg‐Ala), which was the origin of the Ig heavy chain V region (27–30 position). The IC₅₀ value of its synthetic peptide was 33.9 μg/mL. We suggest that the ACE inhibitory and antihypertensive peptides derived from chicken bone extract may contribute to develop physiologically functional foods or improve food functionality.     

脾脏转移因子提取影响因素的研究

研究了改变转移因子冻融提取法中的冻融次数、透析时间及匀浆介质等因素对转移因子收率的影响。通过对转移因子的有效成分多肽和核糖核酸的提取浓度的测定,发现用去离子水做匀浆介质所提取的多肽和核糖核酸效果较好,反复冻融6次转移因子收率最好,在一定范围内,随着冻融次数的增加,透析液中的多肽和核糖核酸浓度逐渐增加,透析24h多肽浓度趋于稳定,透析12h核酸浓度达到高峰。