猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h蛋白原核表达条件的优化

为了提高猪囊尾蚴排泄分泌抗原（ES Ag）M13h蛋白基因在大肠杆菌中的表达量，试验研究了培养基、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对pET32a-M13h融合蛋白表达量的影响。结果：使用TB培养基于37℃培养3 h后，采用终浓度为0.4 mmol/L的IPTG在37℃、100 r/min诱导培养4小时时，pET32a-M13h融合蛋白表达量最大；SDS-PAGE检测结果表明pET32a-M13h融合蛋白的分子质量与预计大小一致，约为30 ku；Western-blot检测结果表明pET32a-M13h融合蛋白能与猪囊尾蚴多克隆抗体发生特异性反应。     

家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索

为实现家兔BMP7基因原核表达及探索适宜的表达条件,采用PCR技术从pMD18-T-BMP7重组质粒中扩增获得BMP7基因成熟肽片段(mBMP7),构建原核表达工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS,并比较温度、IPTG浓度、诱导时间等因素对目的蛋白表达的影响。结果表明,mBMP7原核表达载体构建正确;工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导均可表达含有家兔BMP7成熟肽的34KDa的融合蛋白,表达产物约占菌体总蛋白的30%。在37℃、0.75 mM IPTG以及诱导150 min时,能取得较高的目的蛋白表达量;在20℃低温条件下,IPTG浓度和诱导表达时间应分别以0.20 mM和7 h为宜;另外,目的蛋白表达对工程菌生长无明显的不利影响。因此,成功地构建了家兔BMP7基因工程菌,并确定了适宜的表达条件,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测

Cecropin-XJ是一种从家蚕幼虫体内分离纯化的具有很强热稳定性、酸碱适应性和广谱抗菌性的新型家蚕抗菌肽。以融合不同标签的表达载体构建pET28a-Cecropin-XJ、pET30a-Cecropin-XJ、pET32a-Cecropin-XJ、pMAL-p2X-Cecropin-XJ重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度等条件,通过对目的蛋白表达的检测分析,选择、建立Cecropin-XJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的技术体系。试验结果表明:采用构建的重组原核表达载体pET32a-Cecropin-XJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达产物形式存在,可溶性蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的Cecropin-XJ融合蛋白纯度可达90%以上。体外抑菌试验显示Cecropin-XJ融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

传染性腔上囊病病毒VP2基因表达条件的优化

用摇瓶培养法，对用作生产传染性腔上囊病基因工程亚单位疫苗的基因工程菌种BL21/pET28a—VP2的表达条件进行了优化研究。其结果为：温度37℃，诱导表达时间3～7h，用乳糖诱导时终浓度为20mmol/L时即达到最高表达量；用IPTG诱导时终浓度为0．33mmol/L时即达到最高表达量；乳糖的诱导效果优于IPTG。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的原核表达

血凝素(hemagglutinin,HA)是禽流感病毒的主要抗原之一,原核表达HA是该抗原特性研究和疫苗制备的关键。利用分子生物学方法构建H5N1亚型的禽流感病毒HA基因原核表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta菌株,用不同IPTG浓度和时间诱导HA表达,检测蛋白表达量,分析不同诱导条件对HA表达效率的影响,以确定最佳诱导条件。重组表达载体pET32a-HA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,获得预期大小的DNA片段,说明HA基因成功插入质粒pET32a。Western blot检测结果表明,IPTG诱导重组菌株成功表达HA蛋白,当诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为6h时,HA蛋白表达量最高。研究结果为HA抗原制备及禽流感疫苗的研究奠定基础。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的原核表达与纯化

为制备高致病性的TGEV毒株重组S蛋白,试验将重组质粒pET28a-TGEV-S2、pET28a-TGEV-S3,转化至E. coli BL21(DE3)表达菌株,设置不同的诱导温度、IPTG浓度和诱导时长对其进行表达条件的优化,并使用纯化试剂盒将其纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组TGEV毒株S蛋白的分子量分别约为28 kDa、30 kDa,在不同诱导条件下均以包涵体形式存在,在28℃条件下以终浓度为1 mmoL·L^-1 IPTG诱导4 h表达量达到最高。结果表明:试验成功制备了TGEV重组S蛋白,为TGEV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗、检测试剂的研究奠定了基础。     

鸡支气管炎病毒N基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

依据Genbank中传染性支气管炎病毒N基因序列,设计引物采用PCR方法从本实验室分离到的病毒株中扩增获得约1 230bp的N基因,并将N基因片段克隆插入pMD18-T载体获得pMD18-T-N;采用酶切(Eco RI、XhoI)的方法从已构建的T克隆质粒pMD18-T-N上获得IBVN基因片段,将其亚克隆插入原核表达载体pET32a,成功构建重组原核表达质粒pET32a-N。将重组质粒转入BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/mL的IPTG在37℃进行诱导,5h后表达量最高。这一原核表达载体pET32a-N的构建为进一步研究核酸疫苗奠定了前期基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

人γ干扰素的高效表达

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a（＋）-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是：培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究

为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度.优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时机等培养条件.研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH 7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5 h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32 mg/L发酵液,菌体密度达到13 OD左右.     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

小尾寒羊YB-1基因全长cDNA克隆与原核表达

采用RT-PCR技术从小尾寒羊睾丸组织获得YB-1基因全长cDNA,并将其编码区重组于融合表达质粒pET32a中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒在大肠杆菌BL21 plys（E）中经不同浓度IPTG诱导后获得表达,但表达量较低,且IPTG的浓度变化不影响目的蛋白的表达量。通过改变筛选抗生素,最终获得了目的融合蛋白的高效表达,为深入开展YB-1蛋白功能研究打下了良好的基础。     

绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因ORF117的克隆及其原核表达

以甘肃景泰疑似羊痘(SP)患病绵羊的皮肤组织中提取的总DNA为模板,经PCR扩增获得SP病毒(SPV)ORF117基因.测序后分析表明,该基因由591个核苷酸组成,编码196个氨基酸;将该基因克隆于pET32 载体中,构建重组表达质粒pET-ORF117,用IPTG在不同条件下诱导表达,确定其最佳表达条件.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子质量为42 ku,主要以包涵体的形式存在.在IPTG浓度为0.1 mM、温度为37℃、诱导6 h时表达量最大,约占菌体蛋白的30%.Western blot试验表明,融合蛋白可被羊痘阳性血清识别,这为研究其在新型疫苗和诊断的研究奠定了基础.     

鸡生长激素受体胞外区原核表达分析

生长激素与其靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合,可以促进动物生长发育和调节新陈代谢。为获得鸡GHR蛋白,试验通过PCR扩增获得GHR胞外区序列。经双酶切后连接入原核p ET-32a(+)表达载体,构建了鸡GHR胞外结构域的原核表达载体。将该重组质粒转入E. coli BL21(ED3)表达菌株。通过IPTG诱导其表达GHR重组蛋白,并探讨不同IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等条件对鸡GHR重组蛋白表达的影响。结果表明:诱导GHR重组蛋白表达的最适条件为IPTG终浓度2.00 mmol/L、诱导时间为4 h、培养温度为37℃,在此条件下,GHR重组蛋白表达量最高。研究结果为后续GHR抗体制备奠定了基础。