犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定

犬细小病毒(CPV)编码的VP2基因容易发生变异,导致病毒嗜性和致病性的改变。为制备一株高致病性的CPV毒株(NY株,基因型为2a型)重组VP2蛋白,构建重组原核表达载体pET28a-CPVVP2,转化E.coli BL21(DE3)表达菌株,通过不同温度、不同IPTG浓度和不同诱导时间等条件的优化进行表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组CPV-NY毒株VP2蛋白(rVP2)的分子质量约为72ku,在不同温度条件下均以包涵体形式存在,在37℃条件下以终浓度为0.2mmoL/L IPTG诱导4h表达量达到最高。rVP2不仅与His标签mAb反应,也能与CPV特异性阳性血清反应,说明rVP2具有良好的反应原性,为CPV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测

Cecropin-XJ是一种从家蚕幼虫体内分离纯化的具有很强热稳定性、酸碱适应性和广谱抗菌性的新型家蚕抗菌肽。以融合不同标签的表达载体构建pET28a-Cecropin-XJ、pET30a-Cecropin-XJ、pET32a-Cecropin-XJ、pMAL-p2X-Cecropin-XJ重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度等条件,通过对目的蛋白表达的检测分析,选择、建立Cecropin-XJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的技术体系。试验结果表明:采用构建的重组原核表达载体pET32a-Cecropin-XJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达产物形式存在,可溶性蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的Cecropin-XJ融合蛋白纯度可达90%以上。体外抑菌试验显示Cecropin-XJ融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

鸡传染性法氏囊病血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。     

猪肺炎支原体P102基因C末端序列的克隆及原核表达

应用DNA重组技术，将猪肺炎支原体P102的C末端基因克隆到pET-28a表达载体上，并构建了重组表达载体；将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，用终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导5h，然后用Bug BusterTM Ni—NTAHis·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行纯化。ELASE检测结果表明：该蛋白具有良好的生物学活性。利用纯化蛋白制备高免血清为检测P102蛋白在真核系统中的表达奠定基础。     

猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化

为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达与鉴定

为获取猪圆环病毒3型衣壳蛋白(PCV3-Cap蛋白),本试验参照PCV3 HBBD1810毒株(GenBank登录号：MK105924)的基因组序列信息合成cap基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a中，对重组质粒进行测序和双酶切鉴定后，将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，对最佳IPTG诱导浓度和诱导表达时间筛选，并对目的蛋白表达后的存在形式进行检测以及对纯化条件进行筛选，透析复性后利用鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体进行Western blot以验证目的蛋白的反应原性。结果显示，通过构建原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白；破菌处理后目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中；0.2 mmol/L IPTG 37℃下诱导培养8 h后蛋白表达量较高；在300 mmol/L咪唑洗脱时纯化出清晰条带；经过Western blot验证目的蛋白能够被鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体识别，具有良好的反应原性。结果表明，本试验成功构建了PCV3-Cap蛋白表达载体，成功表达PCV3-Cap蛋白，同时优化了表达和纯化条件，为PCV3亚单位疫苗的研制以及检测试剂盒的开发和研究提供...     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)S1基因(1—1 566bp),体外表达S1基因抗原表位预测区Sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析S1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将S1基因抗原表位预测区Sa克隆至原核表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b-Sa,转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达、超滤柱浓缩纯化重组蛋白、Ni柱亲和层析,Western blot检测Sa蛋白的活性,将Sa蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果表明,CHN-2015毒株S1基因开放型阅读框大小为1 566bp(GenBank No.KY398009),编码522个氨基酸,是具有亲水性的非跨膜蛋白,存在15个潜在的B细胞抗原表位;原核表达Sa重组蛋白,该蛋白质在37℃下用终浓度为0.8mmol·L~(-1)IPTG诱导5h后,蛋白质主要以可溶性形式存在,免疫印迹显示表达的Sa蛋白在上清与包涵体中都有良好的反应性;用纯化的Sa蛋白四次免疫家兔,获得的兔抗Sa蛋白抗体效价可达1∶10 240。本研究克隆了S1基因,原核表达了Sa蛋白和制备了高效价的兔抗Sa蛋白抗体,具有良好的免疫原性,为后续深入开展S蛋白的功能研究奠定了基础。     

抗硬蜱亚单位疫苗用候选抗原蛋白的筛选及免疫原性分析

对已经构建保存的PET-28a-GSTK1、PET-28a-GSTE3、PET-28a-Fe1、PET-28a-Fe2和PET-28a-CPL质粒,利用PCR技术检测目的基因,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测5种重组蛋白(rGSTK1、rGSTE3、rFe1、rFe2和rCPL)的表达,利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化4种重组蛋白(rGSTK1、rFe1、rFe2和rCPL),并使用BCA蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,经Western blot测定4种重组蛋白的反应原性,采用间接Elisa测定多克隆抗体效价以及免疫后抗体消长规律。结果显示,5种目的基因条带正确,并未发生丢失;SDS-PAGE检测发现除rGSTE3外,其余4种蛋白(rGSTK1、rFe1、rFe2和rCPL)均能稳定表达且大小分别为28、25、26、27 kDa,以包涵体形式表达;利用His标签纯化蛋白后测定蛋白浓度,结果显示,以250 mmol/L咪唑进行洗脱时可获得高纯度的目的蛋白,蛋白质量浓度分别为2.633、2.532、2.582和2.506 g/L;将纯化后的重组...     

抗传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

选取传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41毒株S1蛋白的重要抗原区,RT-PCR扩增选定的S1基因并构建pET-28a-S1重组表达载体,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot结果显示重组S1蛋白表达正确。以纯化的S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备并获得了抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体3D9。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)结果显示,单克隆抗体3D9可与IBV M41毒株反应。成功表达了截短的IBV S1蛋白并获得了能识别IBV M41毒株的单克隆抗体,为IBV检测方法的建立奠定了基础。     

猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1毒株毒力基因UK,获得重组蛋白(DP96R),进一步制备并鉴定DP96R重组蛋白的多克隆抗体。首先构建原核重组表达质粒pET-28a-UK并转化BL21感受态细胞,在16℃、0.4 mmol/L IPTG条件下诱导10 h后,检测到目的蛋白以可溶性表达为主,蛋白分子量约为15 kDa。然后采用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DP96R蛋白多克隆抗体。ELISA结果表明制备的多抗具有良好反应性,Western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的DP96R蛋白。DP96R重组蛋白及多克隆抗体的制备为进一步研究DP96R蛋白的生物学功能以及建立ASFV毒株鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。