马动脉病毒GL蛋白基因的分子克隆及序列测定

<正>马动脉炎病毒(Equine areritis virus,EAV)是马病毒性动脉炎(equine viral arteritis,EVA)的病原体,由于其能够引起孕马流产、传播快而引起学者们的关注。EAV是套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员,是线性单股正链RNA病毒。EAV含有7个     

山东、河南、河北驴群马动脉炎病毒和马疱疹病毒8型的检测与分析

为了解我国山东省、河南省、河北省驴群中马动脉炎病毒(EAV)和马疱疹病毒8型(EHV-8)的感染现状,于2020年从3个省份的屠宰场和驴场收集驴血样品共计860份.通过RT-PCR和PCR方法分别对血样进行EAV和EHV-8检测,统计其阳性率和混合感染率,并分析其流行情况;同时,对3个省份EAV和EHV-8阳性样品的O...     

贵州省部分马病血清学调查

[目的]调查贵州省马群马流感病毒、马疱疹病毒1/4型或马动脉炎病毒感染情况。[方法]用酶联免疫吸附试验（ELISA）对采自贵州省9个市（州）及第九届民运会参赛马匹的363份血清进行了A型流感病毒、马疱疹病毒1/4型、马动脉炎病毒和非洲马瘟病毒抗体检测。[结果]结果显示这四种病原的血清抗体群阳性率分别为79.49%（31/39）、7.69%（3/39）、43.59%（17/39）和0%（0/39）,贵州本地役用马和赛马差异不显著（P>0.05）;血清抗体个体阳性率分别57.85%（210/363）、1.38%（5/363）、11.29%（41/363）和0%（0/363）,其中贵州本地役用马阳性率分别为38.16%（87/228）、4.39%（1/228）、8.33%（19/228）和0%（0/228）,赛马阳性率分别为91.11%（123/135）、2.96%（4/135）、16.30%（22/135）和0%（0/135）。相比之下,A型流感病毒及马动脉炎病毒抗体阳性率存在差异（P＜0.01或0.01＜P＜0.05）,马疱疹病毒1/4型病毒抗体阳性率差异不显著（P>0.05）。[结论]调查表明贵州省部分马群存在不同程度的马流感病毒、马疱疹病毒1/4型或马动脉炎病毒感染。     

实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒

选取马动脉炎病毒(EAV)基因组中高度保守的开放阅读框7(ORF7)序列，设计了特异性引物和TaqMan探针，利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线，证明该方法可以检测出含有5(4．77)个RNA分子，即可从组织培养液(TCF)中检出一般含有5PFU／μL病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应，特异性好。用疫苗用种毒(Bucyrus标准株)肌肉注射于马驹后，定量RT-PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对456份临床鼻腔分泌物样品检测，定量RT—PCR检出6份阳性，而病毒分离只检出2份阳性。一步法实时定量RT—PCR检测样品中的EAV，在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法，可以作为检测马病毒性动脉炎(EVA)病毒的快速方法。     

马病毒性动脉炎的研究现状

马病毒性动脉炎(Equine viral arteritis,EVA)又叫马传染性动脉炎,是由马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)引起的,在马属动物之间通过呼吸道和生殖器官传播的一种急性传染病.该病曾被笼统的包括在"马流感"之内[2].1953年,首先在美国俄亥俄州发现本病,Doll等人从马流产胎儿中分离出病毒,并定为Bucyrus株.本病目前在世界许多国家存在.已报道分离出病毒的国家有瑞士、波兰、奥地利、加拿大,其抗原性均与Bucyrus株一致.还有一些国家如英国、日本、法国、西班牙、爱尔兰、葡萄牙、前南斯拉夫、埃及、埃塞俄比亚、摩洛哥、墨西哥、前苏联、德国、瑞士、伊朗、丹麦、荷兰、澳大利亚、新西兰、意大利等国经血清学调查证实有本病存在[4～9]. EVA为二类传染病[10],世界各国在马匹的进出口检疫中十分重视.我国尚未见有本病的报道[1],但我国出口到韩国的马匹,被对方的检疫机关检出EAV抗体阳性[15].     

马病毒性动脉炎诊断技术研究进展

马病毒性动脉炎(EVA)是马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病,是危害养马业及赛马比赛的重要疾病之一,应用各种诊断技术对该病做出准确的诊断是预防和控制该病的前提.EVA的诊断技术包括检测病毒,检测血清抗体,涉及的技术和方法包括病毒的分离及中和试验、血凝及血凝抑制试验、免疫荧光试验以及酶联免疫吸附试验等.每种诊断技术都有其各自的优势和局限性,应根据目的及工作条件等综合情况予以选择,论文就各种诊断技术的原理、方法及特点进行了概述和比较,并对今后的应用前景和发展趋势进行了展望.     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验与微量中和试验的对比研究

195 5年在美国俄亥俄州 Bucyrus地区某牧场的马群暴发急性马病毒性动脉炎 ,主要发生于妊娠母马并引起流产 ,其特征性病理变化为病变器官小动脉膜变性和坏死 [1]。随后 Doll等从流产的胎儿组织中分离出病毒 ,并命名为马动脉炎病毒 (EquineViral Arteritis,EAV) ,后该分离株 (Bucyrus株 )被称为马动脉炎病毒的原型病毒。目前 ,从血清学调查来看 ,该病分布于世界各国 ,严重影响养马业的发展 ,甚至造成严重的经济损失 [2～ 4 ]。马动脉炎病毒是一种有囊膜的负链 RNA病毒 ,在分类上与猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine Reproductive andResp…     

马动脉炎病毒Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对EAV Bucyrus株ORF7基因序列的特异性引物,建立了检测EAV的Eva Green荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)方法.结果表明,该方法在102拷贝/μL～107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低检出量为1015 TCID50/mL病毒,敏感性为常规RT-PCR的100倍,与其他马常见病毒无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于2％,具有较好的重复性.此外,采用该方法测定了EAV Bucyrus株及其拯救病毒icEAV感染RK-13细胞后的复制动态,并与TCID50方法进行了比较.结果显示icEAV与其亲本病毒接种RK-13细胞后,0h测定病毒TCID50及拷贝数分别为103.33TCID50/mL(1 04 65拷贝/2μL)和10350 TCID50/mL(104 70拷贝/2μL);60 h时,细胞病变达到100％,icEAV及其亲本病毒的TCID50及拷贝数分别为105.67TCID50/mL(107 0拷贝/2μL)和105.57 TCID50/mL(106 98拷贝/2μL),两株病毒在RK-13细胞内的复制效率相似.本研究建立的Eva Green qRT-PCR方法可以为细胞培养物中EAV的检测提供有效的技术手段.     

马病毒性动脉炎的研究进展

马病毒性动脉炎(EVA)是以危害生殖器和呼吸道为主要特征的马特有的传染病。本病自1953年由美国Doll等从马流产死胎体内首次分离病毒以来,到目前为止该病毒仍是导致马流产的主要病因之一。本病的重要特征是,马患病后分布于肌肉和各脏器小动脉中的膜发生     

马病毒性动脉炎血凝及血凝抑制试验研究与应用

在RK-13细胞上培的马动脉炎病毒在4℃、室温和37℃条件下，用各种动物的红细胞进行血凝试验，证实病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅红细胞，病毒用吐温-80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其血凝滴度比未经处理的病毒高4-8倍，且血凝像更加清晰，最适处理条件是病毒在冰、浴状态下用终浓度0.06%-0.125%(V/V)二温-80振荡处理15min-60min，再加50%（V/V）乙醚振荡作用5min-15min。用EAV免疫SPF豚鼠，4周后采血做HI和NT试验，显示HI抗体和NT抗体产物成正相关，对550份来自新西兰、吉尔吉斯、内蒙古、新疆的马血清做EAV的抗体检测，比较两个试验，二者符合率为97.8%，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关，但抗体效价略低于后者。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒（EAV）免疫SPF豚鼠，4周后采血做血凝抑制试验（HI），其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应，抗原和抗血清在4℃感作24h后可以检测到最高的HI抗体效价，同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关。对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验（NT）进行EAV抗体检测，HI和NT阳性符合率为94．7％，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关。     

西方马脑炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

通过RT-PCR从西方马脑炎病毒(WEEV)中扩增得到1 317bp特异的保守序列,将其克隆到pMD-20T载体中,进行体外转录,制备标准品cRNA。以10倍比稀释的cRNA为模板,进行TaqMan MGB荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立了WEEV荧光定量RT-PCR检测方法。对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明,建立的荧光定量RT-PCR方法最低可检测10拷贝的cRNA;且与马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV,H3N8)、西尼罗病毒(WNV)、东方马脑炎病毒(EEEV)和日本脑炎病毒(JEV)不发生交叉反应。与常规RT-PCR相比,该方法更加快速,特异性和敏感性更高,灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。     

PRRSV感染的神秘本质

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是动脉炎病毒属(Arterivirus)的一员,其他成员还包括小鼠乳酸脱氢酶-升高症病毒(Lactate Dehydrogenase-elevating Virus,LDV)、马动脉炎病毒(Equine Arteritis Virus,EAV)和猕猴出血热病毒(Simian Hemorrhagic Fever Virus,SHFV).     

马动脉炎病毒实时RT-PCR检测方法的建立

选取马动脉炎病毒基因组中高度保守的开放阅读框7序列,设计了特异性引物和TaqMan探针,利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测马动脉炎病毒.分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品做扩增曲线,两曲线斜率之差小于0.1,证明两者的扩增效率相同,可用选定检测序列的克隆标准品对马动脉炎病毒进行定量检测.该方法敏感,快速,准确,且无交叉污染,能满足海关及检疫部门对马动脉炎病毒快速、准确的检测要求.     

马动脉炎病毒的血凝性研究

在RK－13细胞上培养的马动脉炎病毒（Equine viral arteritis,EAV)在4℃、室温和37℃条件下，用多种动物的红细胞进行血凝试验，病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅的红细胞。将病毒用吐温－80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其HA效价比未经处理的病毒高4－8倍，且血凝像更加清晰。处理病毒的最适条件是在冰浴状态下用终浓度0．6－1．25mL/L吐温－80振荡处理15－60min，再加1／2体积的乙醚振荡作用5－15min.     

马病毒性动脉炎病毒中和试验的建立以及与ELISA方法的比较研究

参照世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断与疫苗手册》,建立了马病毒性动脉炎病毒中和试验,并采用马病毒性动脉炎病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VNT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法,对广东省部分地区马场共182匹马血清和7份标准阴阳性血清进行马病毒性动脉炎抗体的检测,并对两种方法进行比较分析,结果两种方法的阳性符合率和阴性符合率分别为43.48%和96.34%,总符合率为93.12%;以我们建立的VNT作为马病毒性动脉炎抗体检测的"金标准",试验中所用的ELISA方法的敏感性和特异性分别为71.43%和93.96%。因此,我们认为在马病毒性动脉炎抗体检测中,ELISA的敏感性以及与VNT的阳性符合率较低,不适合作为VNT的替代方法。     

非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲马瘟病毒（AHSV）S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒（BTV）、马流感病毒（EIV）、马动脉炎病毒（EAV）等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×101 copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。     

马动脉炎病毒进化分析及DNA条形码的确定

从GenBank数据库下载马动脉炎病毒所有基因组全序列和同属的其他病毒基因组序列,对其进行多重比对,绘制系统进化树,并根据序列比对筛选保守序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码。结界发现马动脉炎病毒分为两个分枝,即欧洲型和美洲型,两者同源性在85%以上,而与同属其他病毒同源性低于40%,亲缘关系较远;对马动脉炎病毒基因组序列进行分析,筛选出9条基因序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码,可用于马动脉炎病毒的鉴别诊断。