阻断ELISA与病毒中和试验检测PPR抗体的比较分析

为选择一种简便、快速、敏感性高、特异性好的小反刍兽疫(PPR)血清学检测方法,本实验收集了506份山羊和绵羊血清样品,采用ELISA和病毒中和试验(VNT)两种方法对PPR病毒(PPRV)抗体进行检测。结果显示ELISA和VNT检出的阳性率分别为44.9%和48.6%。两种方法的符合率Kappa值为0.925,表明这两种方法具有较高的一致性,但ELISA更简便、快速、敏感,更便于基层单位使用。本研究为PPR血清流行病学调查及疫苗免疫效果评价方法的选择提供相关的技术参数。     

应用固相竞争ELISA、液相阻断ELISA和中和试验检测口蹄疫抗体的比较研究

为了评价建立的口蹄疫固相竞争酶联免疫吸附试验(solid phase competition ELISA,SPC-ELISA)方法与传统的中和试验(VNT)和液相阻断酶联免疫吸附试验(liquid phase block ELISA,LPB-ELISA)检测方法之间的关系,本研究对野外采集的不同种类的猪、牛和牦牛共94份血清样品分别进行O型口蹄疫病毒SPC-ELISA、LPB-ELISA和VNT检测,并分别比较3种方法的符合率和阳性检出率。结果表明,建立的O型口蹄疫病毒SPC-ELISA方法与VNT 具有很好的符合率,达88.3%,其中,猪和牦牛血清符合率高达90%和89.5%,阳性检出率为91.2%比LPB-ELISA更符合VNT,因此建立的SPC-ELISA方法比LPB-ELISA方法更符合VNT。     

A型口蹄疫抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为评价A型口蹄疫疫苗免疫水平,本研究以本实验室前期制备的口蹄疫病毒(FMDV)的单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 9A9作为检测抗体,建立了基于MAb的检测A型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法,并对其条件进行优化。结果显示,MAb 3D9的包被浓度为1.16μg/mL,A型FMDV抗原的最佳稀释度为1:5,HRP标记的MAb 9A9的最佳稀释度为1:5 000,当血清132稀释时,检测的临界值确定为35%。利用该方法分别检测A型、O型口蹄疫抗体阳性标准血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清。结果显示,除A型口蹄疫阳性标准血清为阳性结果外其余均为阴性结果,未出现交叉反应,表明本研究建立的方法特异性强。该方法对经病毒中和试验(VNT)检测为阳性的3份血清进行敏感性试验,敏感性分别为1:1 024、1:256、1:128,均高于VNT,表明其敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。利用该方法与液相阻断ELISA方法(LPBE)和VNT对112份血清样品同时检测,分析三者相关性。结果显示,本实验建立的SPCE方法与二者的相关系数分别为0.901和0.916,表明该方法可靠性较好且与VNT的相关性更高。进一步利用本研究建立的SPCE方法和韩国Jeno A型FMDV ELISA抗体检测试剂盒同时检测470份临床血清样品(90份羊血清、170份牛血清和210份猪血清),结果显示该方法检测羊血清、牛血清和猪血清与Jeno试剂盒总体符合率分别为90.0%、91.8%和89.0%。表明该方法的检测结果较为准确。本研究为建立A型口蹄疫检测方法奠定了基础。     

ELISA和微量凝集法检测马流产沙门菌血清抗体的比较

为比较微量凝集(MSAT)和间接ELISA方法检测马流产沙门菌血清抗体的检出率和符合率,本试验分别用全菌包被间接ELISA、MSAT法对采集的191份马血清及标准阴阳性血清进行马流产沙门菌抗体的检测,并对两种方法进行比较分析。MSAT法和间接ELISA法的阳性检出率分别为45.03%和47.12%,MSAT法与间接ELISA法的符合率为89%。MSAT法不需要精密的仪器,便于操作,操作周期短,但存在观察时的人为误差;间接ELISA具有较高的敏感性、特异性和准确性。在实践中可以将两种方法相结合使用。     

猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的临床应用研究

采用猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒对5省/市的猪血清样本进行检测,并与进口ELISA试剂盒相比较,同时采用世界动物卫生组织(OIE)指定方法-荧光抗体病毒中和试验对检测结果有差异的血清样本进行验证,结果显示,两种试剂盒对田间临床样本的符合率为78.1%;猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒与荧光抗体病毒中和试验的符合率高于进口ELISA试剂盒;综合免疫背景分析,猪瘟病毒间接ELISA抗体试剂盒的敏感性和特异性均高于进口试剂盒,更适合在我国进行大规模推广应用。     

基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体(MAb)5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1:128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%(15/15),阴性符合率为77.8%(14/18)。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。     

应用三种方法筛选猪瘟抗体阴性猪的比较试验

为了寻找筛选猪瘟抗体阴性猪更简便的方法,本试验应用猪瘟中和试验(SN)、阻断ELISA和正向间接血凝(IHA)三种方法分别对170份未经猪瘟活疫苗免疫的仔猪血清进行猪瘟抗体检测。结果显示,SN、ELISA和IHA检测出的猪瘟阴性血清分别为144份、150份和131份,表明三种检测方法有较好的符合率,其中SN与ELISA的检测符合率为90.59%,SN与IHA的检测符合率为82.94%,而ELISA法与另两种方法比较阴性符合率最高。本结果表明,ELISA法具有较高的敏感性,适合应用于猪瘟活疫苗安全检验抗体阴性猪的筛选。     

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.     

猪瘟病毒中和性单克隆抗体制备及阻断ELISA方法建立

采用毕赤酵母表达的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠，经间接免疫荧光(IFA)筛选，获得了17株特异性单抗。经病毒中和试验(VNT)验证，上述单抗均具有CSFV中和活性，其中单克隆抗体3H9的病毒中和效价最高，大于1∶10 240。采用HRP标记的CSFV单抗3H9为阻断抗体，配合酵母表达的CSFV E2蛋白作为包被抗原，建立了一种用于检测猪血清中CSFV中和抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后的抗原包被浓度为0.5μg/mL,阻断抗体稀释度为1∶8 000。通过对100份阴性猪血清的检测，确定该方法的阻断率cut-off值为30%。该方法敏感性高，对中和抗体效价低至1∶16的血清检测仍呈阳性；特异性强，仅与CSFV抗体阳性猪血清呈阳性反应，与其他猪病病毒及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体阳性猪血清均呈阴性反应；良好的可重复性，批内、批间变异系数分别为0.90%～3.21%、1.89%～6.57%,均小于10%。对188份现有猪血清检测结果显示，该方法与病毒中和试验和IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合率分别为96.3%、94.7%。用该方法对南京市浦口区某养殖场...     

鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用

本研究以鸭病毒性肠炎(DVE)病毒作为包被抗原,建立了检测DVE抗体的间接ELISA诊断方法.应用该ELISA诊断方法检测DVE阳性对照血清,当血清稀释至12800 倍时,结果仍为阳性;检测其它7种鸭病阳性血清结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于10%;该检测方法与血清中和试验的符合率为100%.DVE 活疫苗皮下免疫鸭抗体监测结果表明:鸭免疫后第7d 可以在血清中检测出DVE特异性抗体.本试验建立的诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DVE免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

马疱疹病毒1型gG蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况,需要建立一种检测抗体的间接ELISA方法。采用纯化后EHV-1 XJ2015株的gG蛋白作为检测抗原,优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比。结果表明,该方法仅与EHV-1阳性血清发生反应,不与马疱疹病毒4型、马流感病毒和马动脉炎病毒阳性血清发生反应,血清稀释1∶1 600后,仍可以检测到阳性,组内及组间变异系数均小于5%。与试剂盒进行检测结果比较,符合率为93.35%。建立了EHV-1 gG蛋白间接ELISA检测方法,可为EHV-1的快速诊断、流行病学调查及防控工作提供技术支撑。     

埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立EBOV抗体间接ELISA检测方法,以纯化后的EBOV糖蛋白作为包被抗原,HRP标记山羊抗马IgG为二抗,EBOV阳性马血清和阴性马血清分别为阳、阴性对照,优化反应条件,以EBOV病毒样颗粒免疫获得的高免马血清评价其特异性和敏感性,并将检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相比较,进一步评价EBOV抗体ELISA检测方法在EBOV免疫血清抗体水平检测中的应用。优化后的间接ELISA方法可特异性检测EBOV抗体,与西尼罗病毒等的阳性血清均不发生反应,检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相平行。批内、批间试验变异系数均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗体间接ELISA检测方法,为EBOV免疫血清抗体水平检测提供了一种简便、快速的检测方法。     

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。     

三种检测猪伪狂犬病抗体的方法比较

应用血清中和试验(SNT)、乳胶凝集试验(LAT)和PRVgpI抗体鉴别ELISA三种方法检测了42份猪血清中的伪狂犬病抗体效价并进行了比较。结果表明SNT与LAT二种方法的阳性符合率为87.1%(27/31),阴性符合率为90.1%(10/11),总符合率为88.1%(37/42),且SNT的敏感性高于LAT,但PRVgpI抗体与SN和LA抗体无相关性。     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

用酶联免疫吸附试验检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的敏感性和特异性

应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测牛血清中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体的技术已经得到了发展。我们用ELISA方法检测从无IBR病毒牛群中采集的304份血清,其特异性为100%;检测经鼻内疫苗接种免疫后采集的62份牛血清,其诊断敏感性在免疫后第一个月为27.4%,第六个月为100%,检测标准血清中和抗体滴度≥1:2的303份牛血清,其敏感性为100%;463份随意诊断样品经比较试验证明ELISA检出血清阳性牛(61.6%)比标准血清中和试验(49.9%)要高。因此,我们认为ELISA具有技术上的优越性,可以作为一种常规诊断试验来检测牛血清中IBR病毒抗体。     

一种检测乙型脑炎病毒抗体阻断ELISA的建立及其初步应用

流行性乙型脑炎是由日本脑炎病毒(JEV)引起的蚊媒传播人畜共患传染病,严重危害人类和猪、马等动物的健康。为建立检测多种动物血清中JEV抗体的ELISA,应用重组囊膜蛋白和辣根过氧化物酶标记的JEV单克隆抗体建立了检测JEV抗体的阻断ELISA。结果显示:通过对100份JEV抗体阴性猪血清的检测结果进行统计学分析,确定阻断ELISA的判定标准:阻断率(PI)≥34%时判定为阳性,PI≤25%时判定为阴性,25%PI34%时判定为可疑。该阻断ELISA与其他常见猪病毒病抗体阳性血清无交叉反应;批内和批间重复试验的变异系数均小于5%;与商品化ELISA试剂盒的对比检测表明,敏感性为98.5%、特异性为94.3%,两者的符合率为97.2%。应用该阻断ELISA对临床收集的猪、牛和羊共515份血清样品进行检测,JEV抗体阳性检出率分别为74.5%、13.3%和9.2%,抽样的血清中和试验结果与阻断ELISA检测结果的符合率为100%(9/9)。本研究成功建立了可适用于猪、牛和羊临床血清JEV抗体检测的阻断ELISA方法。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒（EAV）免疫SPF豚鼠，4周后采血做血凝抑制试验（HI），其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应，抗原和抗血清在4℃感作24h后可以检测到最高的HI抗体效价，同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关。对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验（NT）进行EAV抗体检测，HI和NT阳性符合率为94．7％，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关。     

传染性支气管炎病毒(M41株)HI试验抗原的特异性和敏感性试验

采用本研究室制备的3批传染性支气管炎病毒(IBV,M41株)HI试验抗原,分别对100份和80份不同鸡血清进行IBV HI抗体检测,同时用IBV ELISA抗体检测试剂盒进行检测,比较两种不同方法检测的特异性和敏感性。结果显示,特异性试验中80份SPF鸡血清,自制抗原检测均为阴性,IBV ELISA检测79份为阴性,10份其他鸡病血清,两种方法检测9份均为阴性,10份IBV阳性血清两种方法检测均为阳性;敏感性试验中,74份已知IB疫苗免疫或IBV M41株感染鸡血清IBV HI检测72份为阳性,阳性检出率为97.3%(72/74),IBV ELISA检测74份均为阳性,阳性检出率为100%(74/74),SPF鸡血清及其他鸡病血清,两种方法检测均为阴性,两种检测方法总符合率为97.5%,差异不显著(P0.05)。试验结果证明,本研究室自制抗原具有良好的特异性,特异性为100%,抗原同时具有良好的敏感性,但IBV ELISA方法的敏感性要高于IBV HI方法。