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相似文献
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1.
首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。  相似文献   

2.
试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.01),脂质体方法显著低于对照组(P0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。  相似文献   

3.
试验旨在研究脂质体介导基因转染水牛肾脏成纤维细胞时如何获得较高的转染效率。本研究将以绿色荧光蛋白基因为标记基因,利用Lipofectamine LTX介导外源DNA转染水牛肾脏成纤维细胞,探讨脂质体用量、质粒用量、质粒大小、转染时间、细胞初始接种密度对转染效率的影响。结果表明,4 μg pmaxGFP质粒DNA与4 μL脂质体转染6 h,其细胞活性达98%,可获得较满意的转染效率。  相似文献   

4.
《中国兽医学报》2015,(7):1046-1050
以犬瘟热病毒(CDV)的核衣壳蛋白基因(N基因)和血凝素蛋白基因(H基因)作为靶基因,各设计并体外合成小干扰RNA,分别为N1、N2、N3和H1、H2、H3。将6对siRNA分别转染非洲绿猴肾细胞(Vero)并在转染后接种CDV,48h后通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光、TCID50、荧光定量PCR等方法对2组6个siRNA抑制CDV在Vero细胞中增殖的效果进行比较研究。结果显示,转染细胞感染CDV 48h后,6个siRNAs干扰组细胞出现的绿色荧光明显少于对照组,病毒感染滴度分别是对照组的1/293、1/11、1/29、1/83、1/302和1/90,6个干扰组的CDV基因拷贝数分别是对照组的12.96%、57.75%、23.47%、31.82%、12.82%、15.58%。结果表明,6对siRNAs均对CDV在Vero细胞中的复制具有不同程度的抑制作用,且以H2组抑制效率最高。  相似文献   

5.
为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.0...  相似文献   

6.
试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFPNR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFPNR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。  相似文献   

7.
构建了带绿色荧光蛋白基因及鸡氨肽酶N全长基因的真核表达重组载体,重组载体转染BHK-21细胞后12h开始可见绿色荧光,36h荧光最强,试验中转染24h后感染IBV鸡胚肾细胞适应毒,72h收获病毒接下一次转染的BHK-21细胞,如此在转染细胞上连续传5代,用间接免疫荧光检测各代次病毒感染转染BHK-21细胞,可见随着代次增加,感染程度增加;病毒毒力EID50逐渐增加,第5代时原病毒毒力基本恢复,半定量RT-PCR检测各代次病毒也可见病毒含量逐渐增加。结果表明,鸡氨肽酶N转染至IBV非易感的BHK-21细胞系后,BHK-21细胞变得对IBV敏感,鸡氨肽酶N可能用作IBV感染的细胞受体。  相似文献   

8.
旋毛虫P53ES抗原基因的克隆及真核表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
应用RT-PCR方法扩增旋毛虫ES抗原P53基因,构建P53基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7.于转染24 h后在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转染细胞;同时通过westen blot分析证实了P53基因表达产物的抗原性.结果表明,P53基因在COS-7细胞中表达获得了表达,而且其融合蛋白具有免疫原性.  相似文献   

9.
《畜牧与兽医》2014,(6):20-22
本试验的目的是优化转染条件,提高在阳离子脂质体LipofectamineTM 2000介导下鸡TRPV6基因RNA干扰(RNAi)质粒转染入成骨细胞的效率。将携带绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pSIREN-retroQ-shTRPV6在LipofectamineTM2000介导下转染至鸡成骨细胞,对转染前细胞融合度、质粒质量与脂质体体积比及转染时间进行优化,在荧光倒置显微镜下观察并计算转染效率,MTT法检测在不同质粒质量与脂质体体积比条件下成骨细胞的活性。结果表明,在转染前细胞融合达到90%以上,质粒DNA与脂质体比例为1∶2.5时转染效率最高,并且在转染后48 h转染效果最好,对细胞的毒性作用较小。本试验优化了脂质体介导转染鸡成骨细胞的条件,提高了转染效率,为用RNA干扰技术研究鸡TRPV6基因功能奠定了基础。  相似文献   

10.
试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1:2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。  相似文献   

11.
旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位.本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-LPL.聚乙烯亚胺(PEI)介导pEGFP-C1-LPL转染NIH-3T3细胞,48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并用RT-PCR方法检测LPL mRNA在细胞内的表达.结果,成功克隆出山羊LPL基因1 530 bp长的cDNA,完整阅读框大小为1437 bp,共编码478个氨基酸,GenBank登录号为GU082383.信号肽区域预测结果表明LPL蛋白含有一小段信号肽序列,其可能性为100%.信号肽酶切割位置在第23和24个氨基酸之间,其可能性达到65.9%.成功构建融合表达载体pEGFP-C1-LPL,并且RT-PCR显示转染后LPL在mRNA水平上表达明显.EGFP-LPL融合蛋白定位在NIT-3T3细胞外和细胞膜部分.结果表明,首次成功克隆出徐淮山羊LPL基因cDNA;重组质粒pEGFP-C1-LPL构建成功,并在NIH-3T3细胞中明显表达.  相似文献   

12.
研究旨在克隆徐淮山羊过氧化物酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白对该基因产物亚细胞水平定位。采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织PPAR基因cDNA,并构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-PPAR,聚乙烯亚胺(PEI)介导基因转染NIH-3T3细胞,48h后荧光倒置显微镜下观察基因表达产物的分布,RT-PCR检测mRNA在体外水平的表达。结果表明:首次成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的全序列cDNA,大小为1428bp,GenBank登录号为GU082382;构建了融合表达载体pEGFP-C1-PPAR;RT-PCR检测mRNA表达明显;EGFP-PPAR融合蛋白定位在NIT-3T3细胞质中。体外克隆的徐淮山羊PPAR基因cDNA,在单细胞水平上可表达于细胞质中,结果为进一步研究PPAR的生物学功能奠定基础。  相似文献   

13.
ABSTRACT

1. In order to increase the efficiency of generating transgenic chicken, this trial focused on two points: primordial germ cells (PGCs)transfection in vivo and a germline-specific promoter.

2. In order to transfect PGCs in vivo, two plasmids (pZB-CAG-GFP, pCMV-ZB)were co-injected into chicken embryos via the subgerminal cavity at Hamburger and Hamilton (HH) stage 2–3 or via blood vessel at HH stage 13–14. Results showed that the percentage of GFP+ embryos, viability and hatching rate of embryos injected at HH stage 13–14 were significantly higher than that at HH stage 2–3.

3. Two plasmid transposon systems were used for chicken embryo micro-injections. The donor plasmid, with a green fluorescent protein (GFP) reporter gene, was mediated by the ZB transposon. The helper plasmid was a transposase expression vector driven by the promoter of the chicken vasa homologue (Cvh) gene or Human cytomegalovirus (CMV) promoter. Results showed that 60.98% of gonads in Cvh group expressed GFP, which was 52.50% higher than seen in the CMV group. Only gonad tissue from the Cvh group showed any GFP signal, whereas both gonads and other tissues in the CMV group showed green fluorescence.

4. The data suggested that ZB transposon-mediated gene transfer was efficient for transfecting PGCs in vivo; the Cvh promoter drove the transposase gene specifically in the germline and increased the efficiency of germline transmission. Blood vessels injection at HH stage 13–14 may be a more efficient route for PGCs transfection in vivo.  相似文献   

14.
以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞(Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs),比较磷酸钙、脂质体(梭华-Sofast)、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶(AKP)活性和阶段特异性表面抗原-1(Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1)免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体(梭华-Sofast)、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明:与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率(68% vs 39%、65%,19.70% vs 2.92%、9.73%),差异显著(P〈0.05)。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。  相似文献   

15.
为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及Hoechst 33342染色评价转染效率。结果表明,对于同一时期、同一转染试剂,pcDNA3.1-EGFP转染效果优于pEGFP-C1;不同转染试剂之间,Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染效果优于FuGENE HD。Lipofectamine 3000转染后分化72h肌管最明显,FuGENE HD次之,X-tremeGENE HP转染后细胞死亡较多。采用1.0μL Lipofectamine 3000、1.5μL Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染细胞后EGFP表达量极显著高于FuGENE HD (P<0.01),但这三者之间差异不显著(P>0.05)。细胞转染效率与EGFP定量结果基本一致,1.0、1.5μL Lipofectamine 3000转染效率较高,分别达26.07%和24.77%,极显著高于FuGENE HD(5.59%)和X-tremeGENE HP(10.87%)的转染效率(P<0.01),但二者之间无显著差异(P>0.05);X-tremeGENE HP的转染效率极显著高于FuGENE HD (P<0.01)。综合考虑转染试剂的用量、细胞毒性及经济效益,本试验初步认为牛原代骨骼肌卫星细胞转染宜采用Lipofectamine 3000,其与质粒DNA的比例为1∶1时转染效率最高。本试验结果可为原代细胞的转染提供重要的参考价值。  相似文献   

16.
为研究CRISPR/Cas9腺病毒载体在鸡胚中进行基因敲入的可行性,将包装不同滴度增强型绿色荧光报道基因(Enhance green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体和慢病毒载体显微注射到HH14时期鸡胚的外周血管中,对胚胎发育至3.5 d和9 d鸡胚存活、各器官中EGFP荧光强度等指标进行检测;将包装CRISPR/Cas9系统的腺病毒载体和Donor片段的腺病毒载体共同显微注射到鸡胚后,对成年公鸡各器官中EGFP荧光长期表达、EGFP基因敲入等指标进行检测。结果显示:两种病毒载体对鸡胚心脏和性腺的转染效率呈现显著的滴度依赖性,但1×1011TU/mL的EGFP腺病毒载体将9 d鸡胚存活率从93.18%显著降低至64.11%(P<0.05);选择滴度为1×1010TU/mL的CRISPR/Cas9腺病毒和Donor腺病毒载体进行EGFP的基因敲入,注射后成年公鸡多个组织均能稳定表达绿色荧光,PCR检测证明该荧光来自EGFP的基因敲入。研究提示:腺病毒载体比慢病毒载体具有更高的鸡胚转染效率,使用CRISPR/Cas9腺病毒载体可以在鸡胚中实现高效的EGFP基因敲入。  相似文献   

17.
试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID50法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数(MOI)值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率(%)。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3~4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×1011 PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。  相似文献   

18.
This paper describes a preliminary evaluation of particle-mediated bombardment via the Helios gene gun for the delivery of therapeutic genes to synovial cells in culture. A reporter gene, enhanced green fluorescent protein, was delivered to rabbit synovial fibroblasts (HIG-82) using gold particle (1.0 microm) bombardment to evaluate transfection efficiency at helium pressures of 100 and 150 psi. Transfection of cells occurred at these pressures despite some cell death. The in vitro delivery of gold particles to samples of synovial membrane and articular cartilage from a freshly euthanased dog was also studied to examine depth of penetration of gold particles (1.0 microm) at helium pressures of 250 and 500 psi. Light microscopical examination of histological sections of the synovial membrane showed that particles of gold had penetrated the lining cells of the synovium. However, no gold particles had penetrated the articular cartilage even at 500 psi.  相似文献   

19.
试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒(lentivirus)感染水牛颗粒细胞(buffalo granulosa cell,BuGC)、水牛乳腺上皮细胞(buffalo mammary epithelial cell,BuMEC)、水牛成纤维细胞(buffalo fibroblast cell,BuFC)的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数(MOI)。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数(100、200、400、600、800)感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为:BuMEC>BuGC>BuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为:BuGC>BuMEC>BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。  相似文献   

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