3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.01),脂质体方法显著低于对照组(P0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

【目的】 探究敲除Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）复制的影响。【方法】 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞（porcine renal epithelial cells，PK15）系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞，收获慢病毒并感染PK15细胞，经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^-/-多克隆细胞，并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功，分别利用光学显微镜和细胞毒性检测（cell counting kit 8，CCK-8）观察并检测PK15、PK15-TLR7^-/-细胞的形态与活力；利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后病毒增殖情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况；利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后子代病毒产生情况。【结果】 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑，其中sgRNA2的基因编辑效率最高，但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力；当感染VSV-GFP后，通过荧光显微镜观察发现，荧光强度随着时间逐次增加，且PK15-TLR7^-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示，相同时间点的PK15-TLR7^-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞（P<0.05；P<0.01）；实时荧光定量PCR结果表明，感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加，且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）；Western blotting结果表明，PK15与PK15-TLR7^-/-细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达，表达量随时间逐渐增多，且在PK15-TLR7^-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高；感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放，此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^-/-细胞（P>0.05），但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）。【结论】 TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制，初步验证了TLR7在天然免疫中的作用，为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。     

他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

【目的】 研究他莫昔芬（Tamoxifen）在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染的抗病毒作用。【方法】 以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】 他莫昔芬用药浓度在6 μmol/L时对细胞活力无影响;在6 μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响（P>0.05）。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组（P<0.01）;实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达（P<0.01）;Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达（P<0.05;P<0.01）;病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组（P<0.05;P<0.01）。【结论】 他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。     

松辽黑猪NR5A2基因多态性及其与繁殖性状的关联分析

试验旨在探究松辽黑猪NR5A2基因多态性及其与繁殖性状的关联性。选取130头松辽黑猪作为研究对象,利用PCR直接测序法查找NR5A2基因6个外显子的SNP位点,通过HRM分型技术分析SNP位点的多态性,使用SPSS 19.0软件分析NR5A2基因SNP位点多态性与母猪总产仔数、产活仔数、仔猪初生重、3周龄重、断奶重及断奶仔猪数、乳头数的关联性。结果显示,松辽黑猪NR5A2基因第6外显子上存在1个SNP位点（C99T）,检测到3种基因型：CC、CT和TT。群体遗传参数分析及卡方适合性检验结果显示,该SNP位点在松辽黑猪群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）,但C/T突变位点杂合度相对较低,在松辽黑猪群体中的变异较小,属于中度多态（0.25<PIC<0.5）。关联性分析结果表明,在NR5A2基因C99T位点上,CC基因型个体的总产仔数、产活仔数及断奶仔猪数均最高,且显著高于TT基因型（P<0.05）,产活仔数及断奶仔猪数均显著高于CT基因型（P<0.05）;各基因型仔猪初生重、3周龄重、断奶重及乳头数均无显著差异（P>0.05）。综上所述,NR5A2基因第6外显子存在突变位点C99T,与松辽黑猪产仔数存在显著关联性,但该突变位点能否作为松辽黑猪产仔数的遗传标记,需要对更大的群体进行进一步研究。     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素（MSTN）与基质金属蛋白酶（MMPs）的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系：单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调（P < 0.01）;细胞外基质中纤连蛋白（FN）和层连接蛋白（LN）含量均极显著增加（P < 0.01）。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞（P < 0.01）;Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞分化

旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。     

牛胚胎性别鉴定荧光定量PCR方法的优化与应用

旨在建立一种可检测牛早期胚胎性别的复合探针体系,减少常规PCR方法电泳所带来的污染,提高鉴定准确率,降低鉴定成本。本研究以SRY为牛胚胎性别鉴定的目标基因,以进口YCD-PCR性别鉴定试剂盒为对照组（n=9 543）,荧光定量PCR的单引物分别扩增体系（荧光单扩,FSPSA,n=6 570）和双引物混合扩增体系（荧光双扩,FDPMA,n=22 238）分别做试验组,从性别鉴定效率、无反应率、雌雄胚胎百分率和比值、移植妊娠率、雌性胚胎母犊率、不同细胞取样数下的性别鉴定结果和鉴定成本等方面进行各组间比较。结果表明,荧光单扩组的雌性胚胎百分率和性别鉴定效率极显著高于其他两组（P<0.01）,无反应率极显著低于其他两组（P<0.01）,雌雄胚胎比值与其他两组差异较大（1.03∶1 vs 1∶1.03和1∶1.02）,雌性胚胎母犊率极显著低于荧光双扩组和对照组（P<0.01）;荧光双扩组的雌性胚胎百分率、雄性胚胎百分率和雌性胚胎母犊率均与对照组无显著差异（P>0.05）,雌雄胚胎比值与对照组相似（1∶1.03和1∶1.02）,无反应率极显著低于对照组（P<0.01）,性别鉴定效率极显著高于对照组（P<0.01）。取样细胞4~6组和7~10组的性别鉴定效率极显著高于1~3组和SD（separated & died cells）组（P<0.01）,而1~3组和SD组之间及4~6组和7~10组之间差异不显著（P>0.05）。移植妊娠率4~6细胞组最高（49.68%）,但各取样组间无显著差异（P>0.05）。荧光双扩法与对照组相比,鉴定成本下降了46.76%。结果显示,荧光双扩方法产母犊准确率最高,鉴定成本较低,取样4~6细胞时的移植妊娠率最高,是一种更可行的牛胚胎性别鉴定技术,更有利于产业化推广和应用。     

CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。     

Hlcs干扰对C2C12细胞成肌成脂分化后糖酵解基因表达的影响

旨在研究全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase,Hlcs）对糖酵解基因表达的影响,为进一步研究细胞糖酵解奠定基础。本试验以C2C12细胞为试验材料,采用siRNA技术干扰Hlcs基因,通过荧光定量PCR和Western blotting检测Hlcs基因干扰对糖酵解基因表达的影响。结果表明,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与Pfkm、Pkm、Hk-2基因的表达趋势一致,提示Hlcs基因与糖酵解具有相关性。干扰Hlcs后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,糖酵解限速酶Pfkm的mRNA水平显著降低（P<0.05）,而显著提高了Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平（P<0.05）;生物素作为羧化酶的辅酶,能够显著上调Pkm、Hk-2的mRNA水平（P<0.05）。干扰Hlcs后,细胞分化形成的脂滴数量明显少于对照组,Pfkm的mRNA水平显著升高（P<0.05）,且Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;生物素的添加能够显著上调Pfkm、Pkm的mRNA水平（P<0.05）。综上所述,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与糖酵解基因表达趋势一致,且干扰Hlcs基因可以抑制成肌分化C2C12细胞中Pfkm和Hk-2基因的表达,促进Pkm的表达;而促进成脂分化C2C12细胞中Pfkm和Pkm的表达,抑制Hk-2基因的表达。     

利用脂质体法建立转Toll样受体4基因大尾寒羊胎儿成纤维细胞株的研究

利用脂质体转染法获得转Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)基因的成纤维细胞,将其作为供体细胞,再通过体细胞核移植技术构建重构胚,最终生产出转TLR4基因且性别可控的大尾寒羊。本研究通过原代培养大尾寒羊胎儿皮肤成纤维细胞,并进行SRY基因性别鉴定,利用脂质体转染法转入TLR4基因,然后分别从形态学与分子水平检测TLR4基因的表达,将稳定表达转TLR4的成纤维细胞核移植入绵羊去核卵母细胞中构建重构胚。最终获得5个稳定表达TLR4的阳性细胞克隆,经SRY基因性别鉴定为雌性细胞株,通过实时荧光定量PCR分析,在第4代转染的细胞中TLR4表达量最高,比未转染细胞高出7.4816倍(P<0.01),卵裂的重构胚中有EGFP的表达。试验成功构建出含TLR4基因的重构胚,为今后生产出性别可控的抗病转基因绵羊地方新品种奠定基础。     

Establishment of Fetal Large-tailed Han Sheep Fibroblasts Cell Line Transfected with Lipofectamine 2000 Vector Containing TLR4 Gene

Exploiting the method of liposome transfection to obtain modified Toll-like receptors 4(TLR4) gene fibroblast cells as competent donor, build reconstructed embryos, which finally produced transfected TLR4 gene and gender controllable Large-tailed Han sheep by somatic cell nuclear transfer technology.In this study, through primary culturing the fetus dermal fibroblasts from Large-tailed Han sheep, to identify the SRY gene gender.Using the method of liposome transfection transferred TLR4 gene into fibroblast cells, then detected whether TLR4 gene expression stably or not in morphology level and molecular level respectively, transplanting fibroblast cells which stably expressed TLR4 gene into oocytes without nucleus from Large-tailed Han sheep for building reconstructed embryos.To harvest 5 positive clones by fibroblast cells with stable expression level of TLR4.According to the identification of the SRY gene gender, the cell lines were female.The analysis of Real-time fluorescent quantitative PCR, the fourth generation of transfected cells had the highest expression level of TLR4, which were higher than control group in 7.4816 times (P<0.01).The cleavage reconstructed embryos had stable expression level of EGFP.We succeeded in building reconstructed embryos with TLR4 gene and lay the foundation for producing the disease-resistant and gender controllable transgenic sheep in the future.     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

T-2毒素致猪肾细胞损伤及氧化应激相关机理的研究

试验旨在研究T-2毒素对猪肾细胞(PK15)的毒性作用及其氧化应激反应。用不同浓度的T-2毒素处理细胞,通过MTT法检测细胞活性、测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放率及苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态变化评估T-2毒素对细胞的毒性作用;通过检测细胞内的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,评估不同剂量T-2毒素对细胞氧化应激水平的影响;检测Nrf2-ARE信号通路相关基因Nrf2、Keap1、GPx-1、Nqo1及Hmox1 mRNA的表达水平,分析T-2毒素对该信号通路的影响。结果表明,PK15细胞活性呈毒素剂量依赖性下降(P<0.05),LDH释放率呈毒素剂量依赖性上调(P<0.05);随T-2毒素剂量升高,细胞间隙逐渐增加,细胞固缩,细胞数量也随之减少。细胞内ROS阳性细胞率呈剂量依赖性升高,且T-2毒素为100 nmol/L时,ROS阳性细胞率显著高于其他剂量组(P<0.05);细胞内MDA含量与GPx活性呈毒素剂量依赖性升高(P<0.05),而GSH含量呈毒素剂量依赖性下降(P<0.05)。20、50及100 nmol/L的T-2毒素可显著上调Keap1、Gpx-1及Nqo1基因mRNA的相对表达量(P<0.05),且50 nmol/L的相对表达量最高。T-2毒素对K15细胞有毒性作用,可诱导其氧化损伤,且该氧化应激过程受Nrf2-AER信号通路调控。     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。     

食淀粉乳杆菌代谢产物对TGEV感染IPEC-J2细胞屏障功能的影响

本研究采用荧光定量PCR方法,检测了IPEC-J2细胞不同时间点紧密连接蛋白3(claudin 3,CLDN-3)、细胞角蛋白8(cytokeratin 8,KRT8)、黏蛋白1(mucin 1,MUC1)3种蛋白mRNA的表达量变化。本试验将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染IPEC-J2细胞,探索食淀粉乳杆菌代谢产物是否通过维持或改善CLDN-3、KRT8、MUC1蛋白mRNA表达来增强细胞的屏障功能,是否对IPEC-J2细胞感染TGEV后的屏障功能产生影响。试验结果发现,正常细胞对照组MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白mRNA表达量随时间没有显著变化(P> 0.05),MRS培养基对照组与正常细胞对照组相比没有显著变化(P> 0.05),食淀粉乳杆菌代谢产物单独处理组对细胞MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白mRNA表达量呈显著上调作用(P< 0.05);食淀粉乳杆菌代谢产物+TGEV试验组与病毒对照组相比,处理24、36和48 h,MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白的表达显著升高(P< 0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌代谢产物不仅能提高MUC1、CLDN-3及KRT8在IPEC-J2细胞上的表达,还能负调节TGEV诱导的MUC1、CLDN-3及KRT8在IPEC-J2细胞上的表达,从而加强IPEC-J2细胞对TGEV感染的屏障功能。