禽流感病毒M2e特异性多肽ELISA检测方法的建立

本研究人工合成禽流感病毒H5N1亚型M2蛋白的膜外区(M2e),并偶联至半抗原载体血蓝蛋白(KLH),免疫SPF鸡,共免疫3次,每次间隔两周。所获得的阴阳性血清用于ELISA方法的建立,通过方阵滴定确定了人工合成的23肽包被96孔ELISA板的最佳浓度为5μg/mL;1%BSA为封闭液,37℃封闭3 h;被检测血清的最佳稀释度为1∶400,一抗反应时间为37℃,45 min;二抗反应时间为37℃30 min;选用TMB为底物,显色15 min,用2 mol/L H2SO4为终止液为检测血清中抗M2e抗体滴度奠定基础。根据建立的ELISA方法,检测3次免疫2周后的SPF鸡血清中抗M2e抗体,血清开始1∶100倍稀释之后做倍比稀释,测得平均滴度分别为1∶13 500和1∶20 500。     

间接酶联免疫吸附试验显色系统主要影响因素的探讨

酶联免疫吸附试验（ELISA）易受多种因素影响,其中包括显色系统。本文就ELISA常用的四甲基联苯胺（TMB）显色系统的成份、含量及反应条件对ELISA显色状态的影响进行了探讨,制订了一种通用的调整包括pH值、底物成份及含量、反应时间等在内的显色系统参量的方法,应用该方法为确定适用于任一特定ELISA的显色系统以及建立稳定的ELISA体系奠定了基础。     

PDCD4对奶山羊乳腺上皮细胞的凋亡及β-酪蛋白和TG合成的影响

旨在探究奶山羊程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)对乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells, GMECs)凋亡及乳成分的调控作用。本研究通过双荧光素酶报告试验验证miR-21-5p与PDCD4的靶向关系，通过RT-qPCR、Western blot试验检测miR-21-5p对PDCD4的调控作用；将PDCD4干扰小RNA(si-PDCD4)与PDCD4过表达载体(pc3.1-PDCD4)转染进GMECs以探究PDCD4对GMECs的影响，通过EdU、CCK-8试验检测转染后对GMECs增殖的影响，利用流式细胞术检测转染后对GMECs凋亡的影响；利用ELISA试剂盒检测转染后GMECs中β-酪蛋白和甘油三酯(TG)的分泌情况；最后通过Western blot试验检测转染后GMECs中PI3K、mTOR、S6K、ERK、Bcl-2、Bax等蛋白的表达。双荧光素酶报告试验结果表明，PDCD4与miR-21-5p靶向结合；EdU、CCK-8及流式细胞术试验结果表明，过表达PDCD4后GMECs活力显著降低(P<...     

5%锐劲特悬浮剂对家蚕的残毒饲养试验

锐劲特(氟虫腈)是由罗纳普朗克公司开发成功的一种新型苯并吡唑类杀虫剂,具有杀虫谱广、用量低(40￣100g/hm2)、与现有常规杀虫剂无交互抗性等特点,该品种1993年开始进入中国市场。为解决桑树登记农药品种缺乏的现状,加快开发筛选桑树适用农药,浙江省植物保护总站在江浙主要蚕区组织开展了5%锐劲特悬浮剂的药效试验和家蚕残毒饲养试验,现将本站承担的主要试验报告如下。1试验方法1.1处理设置试验设5%锐劲特悬浮剂1000倍、2000倍和4000倍3种农药浓度处理,每种农药浓度再分设间隔3d、7d、15d3个处理及空白不喷药等共10个处理,每个处理重复4次,…     

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究Ⅰ.ELISA方法的初步建立及其标化

以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种务件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。研究结果表明．重组抗原最适包被质量浓度为1mg／L,最适包被条件为4℃过夜．血清稀释度为1：40,待检血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃ 30min和40min．底物用TMB溶液,37℃显色10min。本研究对ELISA板的蛋白稳定剂、血清稀释液的显色系统和终止液进行了研究。用全病毒进行的阻断试验结果表明．全病毒能够阻断阳性血清与包被重组N蛋白抗原的结合反应。用此方法对几种繁殖障碍性疾病的阳性血清进行检测．均为阴性．无交叉反应．表明建立的ELISA具有很好的特异性。板内和板间重复性试验结果为．同1份血清板内各孔的变异系数和板间各次的变异系数均小于7％．表明本方法的重复性好。     

日本乙型脑炎病毒抗NS3和NS5蛋白单克隆抗体的制备

本研究在大肠杆菌中表达了日本乙型脑炎病毒(JEV)非结构蛋白NS3和NS5,并纯化NS3和NS5蛋白,免疫小鼠获得脾淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合筛选得到2株抗NS3蛋白单克隆抗体1H7和2D4,3株抗NS5蛋白单克隆抗体3C4、3H7和3F10。试验通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting和间接免疫荧光检测(IFA)检测了单克隆抗体的活性。结果显示,所有的单克隆抗体1∶100稀释进行IFA和1∶500稀释进行Westernblotting时均具有高特异性和高敏感性。抗JEV NS3和NS5蛋白单克隆抗体的成功制备为进一步研究JEV的蛋白结构和致病性奠定基础。     

硫酸化20(S)一人参皂苷Rh2对小鼠脾淋巴细胞分泌IL -4和IFN -γ的影响

为了进一步评价硫酸化修饰后人参皂苷Rh2的免疫活性变化,试验分别采用MTI法和ELISA法对比研究了浓度为0.2 mg/L、1 mg/L、5 mg/L的人参皂苷Rh2及其硫酸化衍生物(S -Rh2 -1和S - Rh2 -2)对ConA刺激小鼠的脾淋巴细胞增殖和分泌IL -4、IFN -γ的影响.结果表明:S-Rh2 ...     

细胞壁抗原用于布氏杆菌病诊断试验的研究

用培养的布氏杆菌菌体，通过超声波裂解、反复离心制备出布氏杆菌细胞壁抗原。将细胞壁抗原作1：128稀释，用作牛种布氏杆菌酶联免疫吸附试验（ELISA)的抗原；将布氏杆菌细胞壁抗原作1：32稀释，用作平板凝集试验抗原；把细胞壁抗原作1：16稀释用作试管凝集试验抗原，分别建立了牛布氏杆菌ELISA试验、平板凝集试验和试管凝集试验。用这3种方法，检测已知200份平板凝集试验阴性血清，5份平板凝集试验阳性血清。结果5份阳性血清在平板凝集试验、试管凝集试验和ELISA试验中均为阳性；200份阴性血清在平板凝集试验和试管凝集试验中均为阴性，在ELISA试验中有1份为阳性?试验证明，细胞壁抗原，既能用于传统的平板凝集试验和试管凝集试验，又能用于ELISA试验。     

猪瘟抗体免疫金标试纸条在预防猪瘟中的应用

目前监测猪瘟抗体的检测方法主要有ELISA试验、正向间接血凝试验和免疫金标试纸条试验。ELISA试验，操作条件严格，在实验过程中使用了有毒的显色底物溶液，操作步骤程序多，从试剂的配制到实验结果的出现需2～3d，且费时费力，不具有快速、简便的方法原理；正向间接血凝试验，从操作至结果出现的时间为1．5～2h，虽有快速的特点，但试验用的诊断液     

猪细小病毒的猪体回归试验和回归阻断试验

1982年本所在上海郊区二个猪场的有繁殖障碍病的头胎母猪中分离到二株血凝性病毒,证实为PPV.为证实其致病性,作了本动物回归试验和回归阻断试验.一、材料与方法(一)种毒:PPV S—1和 S—2毒株。毒株的分离和鉴定前已报道.S—1毒株为制苗种毒,疫苗制造见文献.S—2毒株为回归试验的种毒.胎猪睾丸(ST)细胞:由中监所周泰冲教授赠送.(二)血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验:试验方法前已报道.(三)病毒分离方法:将血浆或胎儿内脏(肝、脾、肺、肾、小肠、肠系淋巴节)的1∶10混合乳剂接种于 ST 细胞,培养二周,培养液作 HA 试验如 HA 阳性,判为病毒分离阳性.(四)猪体回归试验:将 HI 阴性的怀孕头胎母猪,在孕龄30～40天时分别注射 S—2毒株的细胞传     

Development and Application of a PEDV Nsp7-based Indirect ELISA for Antibody Detection

This study was aimed to establish an indirect ELISA to detect antibodies against different strains of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). Puried nonstructural protein 7(Nsp7) was used as coating antigen, and the indirect ELISA was established by optimizing the ELISA reaction conditions. The results showed that the optimal reaction conditions were as follow:The amount of coating antigen was 0.20 μg/well, and the coating condition was at 37℃ incubation for 1 h then 4℃ overnight; The working dilution of serum samples and HRP-labelled secondary antibody were 1:300 and 1:10 000, and the incubation time were 2 and 1.5 h, respectively; TMB substrate incubation time was 15 min. Serum sample was determined as positive when its S/P>0.1694 and negative when its S/P<0.1398. The ELISA was specific, reproducible and sensitive. Forty samples of suspected PEDV serum samples were tested by the established ELISA, and the coincidence rate between the ELISA and the commercial kit was 95%. The ELISA established in this study could be used clinically to detect the antibody level of different strains of PEDV, and it also had the potential for early diagnosis of PEDV, providing a basis for the development of effective measures to control PEDV.     

重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究

利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。     

猪沙波病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

以原核表达重组蛋白作为抗原建立了猪沙波病毒(SaV)抗体的间接ELISA检测方法。使用矩阵滴定法确定抗原包被浓度为6.4μg/mL,血清稀释倍数为1∶50。试验选用1%BSA作为封闭液,血清和二抗的最佳作用时间分别为60 min和40 min。选择无致癌的TMB为底物,确定TMB最佳反应时间为10 min。通过对20份猪阴性血清样品的检测,计算阳性判定值为0.203。通过交叉试验、批内和批间重复性试验证明,本研究建立的SaV间接ELISA检测方法具有特异性高,重复性好的特点,可用于猪沙波病毒抗体的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳(N)蛋白作为包被抗原,建立了PRRSV抗体检测的间接ELISA方法,并优化确定了ELISA最佳工作条件:重组抗原包被浓度为13.3 μg/mL,37℃1h或4℃过夜;5％脱脂乳37℃封闭2h;血清1:40稀释,37℃作用90 min;酶标二抗1∶4000稀释,37...     

串联表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5表位蛋白间接ELISA方法的建立

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37 ℃封闭2 h;血清最适稀释度为1∶100,37 ℃作用2 h;兔抗猪IgG/辣根酶（HRP）（1∶3000）,37 ℃作用2 h;37 ℃避光显色15 min读取D_{450 nm}值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D_{450 nm}值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D_{450 nm}值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。     

兔病毒性出血症病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

建立一种检测兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法。对RHDV陕西分离株VP60基因进行原核表达,Western blot分析表达产物的免疫反应性;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP60蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为42.34 ku的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被浓度2.9μg/mL,37℃2 h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2 h,待检血清37℃孵育1 h,酶标抗体1∶10 000稀释,37℃作用1 h,37℃显色5 min,临界值为0.340;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与血凝抑制试验的符合率为74.1%,与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%。该方法可用于临床样品的大批量检测。     

Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease)-infected and vaccinated pigs.

A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test has been developed to distinguish pseudorabies virus (PRV) (Aujeszky's disease virus) -infected pigs from those immunized with a glycoprotein g92 (gIII) deletion mutant, PRV (dlg92dltk) [OMNIMARK-PRV]. This blocking ELISA test utilizes an anti-PRV gIII monoclonal antibody (mAbgIII)-horseradish peroxidase (HRPO) conjugate, TMB for color development and a cloned PRVg92 (gIII) antigen to coat wells of microtiter test plates. Undiluted sera are used to block the binding of the mAbgIII-HRPO conjugate to the antigen. The gIII blocking ELISA is specific and has a sensitivity comparable to screening ELISA and latex agglutination tests. PRV-negative sera and sera from pigs vaccinated once, twice, or four times with the gIII-negative vaccine all showed negative S/N values of greater than 0.70 (S/N defined as the optical density at 630 nm of test sera/optical density at 630 nm of negative control sera). Sera from PRV-infected herds, sera from pigs experimentally infected with virulent PRV, and sera from pigs vaccinated with modified-live or inactivated gIII+ vaccines were positive for gIII antibodies (S/N less than 0.7). Sera from pigs experimentally infected with 200 PFU virulent PRV seroconverted to gIII+ antibodies 7-10 days postinfection. Sera from pigs vaccinated with gpX- and gI- vaccines seroconverted to gIII+ antibodies 7-8 days after vaccination. The gIII antibodies persisted after gIII+ vaccinated for at least 376 days postvaccination. Sera from pigs protected by vaccination with PRV (dlg92dltk) and then challenge exposed to virulent PRV at 21 days postvaccination showed gIII+ antibodies by 14 days postchallenge. The specificity and sensitivity of the gIII blocking ELISA assay was further demonstrated on the United States Department of Agriculture-National Veterinary Services Laboratory (USDA-NVSL) sera from the 1988 PRV check set and the 1989 gIII PRV check set by comparing the gIII blocking ELISA assay with virus neutralization, screening/verification ELISA and latex agglutination assays.     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

间接ELISA方法检测血清2型鸭疫里默氏杆菌的研究

应用超声波裂解法制备的血清2型鸭疫里默氏杆菌裂解物作为抗原包被酶标板.以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功地建立了检测鸭血清2型鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELlSA方法.特异性试验和重复性试验证明此方法的特异性高、重复性好.