猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。     

表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建及蛋白免疫原性分析

试验旨在构建能表达牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）E2抗原蛋白的重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），为进一步研制BVDV乳酸菌口服活载体疫苗奠定基础。将BVDV E2基因克隆后测序，根据乳酸乳球菌的密码子偏嗜性进行优化，再将优化的基因片段插入表达载体pNZ8148中，并电转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，构建重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000，经1 ng/mL乳链菌肽诱导表达后，对菌体物进行了SDS-PAGE和Western blotting分析。将重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000口服免疫6~12月龄健康犊牛，在免疫后不同时间点采集血液样品并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体水平。结果显示，PCR扩增到了1 149 bp的目的片段，乳酸菌密码子偏嗜性优化后，GC含量从45.28%变为34.30%。重组质粒pNZ8148-E2经酶切鉴定插入片段与预期大小相符，在菌体裂解物中出现大小约42 ku的条带，与预期蛋白大小一致，且该蛋白可与BVDV E2抗体反应。在免疫犊牛的血清中检测到特异性抗BVDV E2蛋白的抗体。本研究结果表明，表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌口服免疫可诱导犊牛产生特异性的体液免疫反应，该重组菌具有较好的免疫原性。     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列，分析其抗原区域，利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段，将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后，对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收，构建重组质粒pET-32a-G，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白，并测定其浓度；通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示，本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因，获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白，优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大；通过Western blotting检测发现，重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有反应原性。综上，本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白，为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒2b基因的克隆和原核表达

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素亚单位蛋白的制备及免疫原性研究

为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原，本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原，将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化，经序列分析鉴定后，分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中，构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示，构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp，与GenBank中相关序列具有高度同源性；3个蛋白片段表达正常，表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL，SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku；因3个片段位置不同，仅Tox3有Western blotting检测条带，与理论预测相符；使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后，二免后14 d，血清经试剂盒检测阳性率达到100%，对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段，且具有较好的免疫原性。     

中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2cDNA的克隆与原核表达

本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein -2,MD-2)基因,并用Western blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2 cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25 ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2 cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。     

猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析

【目的】 对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因进行克隆及原核表达，为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】 根据GenBank中公布的HO-1序列（登录号：NM_001004027.1），利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段，将其与pMD19-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR鉴定；将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切，使用T4 DNA连接酶连接，利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌，使用IPTG进行诱导表达，应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】 猪HO-1基因全长897 bp，编码298个氨基酸。双酶切后在约5 200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段，证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1；电转后的双酶切结果表明，在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段，证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现，在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹，表明成功表达了HO-1的重组蛋白，且为胞外分泌。【结论】 本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体，pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of Epitope Domain of NSP2 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

This experiment was conduced to express and purify the recombinant NSP2 protein of PRRSV. The NSP2 gene was amplified using PCR method, and then it was subcloned into pET-28a(+) vector and expressed in E.coli. The molecular weight of the recombinant protein was 29 ku. The result of SDS-PAGE indicated that the expression efficiency of the recombinant protein was induced by 1 mmol/L IPTG for 8 h at 37 ℃.Western blotting result showed that the recombinant protein had high immunogenicity and could be recognized with positive serum of PRRSV. In this study, we expressed and purified the recombinant NSP2 protein of PRRSV, and the results laid the foundation for the further development of ELISA methods coated with NSP2 protein.     

表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定

用疑似患猪流行性腹泻病（PED）的病猪肠病料,根据猪流行性腹泻病毒（PEDV）S糖蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增,获得531bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列与PEDVCV777株相应序列的同源性为99．4％。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）501bp片段。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1ng／mL乳链菌肽（Nisin）诱导,通过SDS-PAGE和Westernblot分析,PEDV部分S蛋白成功表达,并具有反应原性。间接免疫荧光试验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。     

Prokaryotic Expression and Purification of 2A Protein of Porcine Encephalomyocarditis Virus

In this study,encephalomyocarditis virus 2A protein was prokaryotic expressed and purified.E.coli was used to express foreign proteins,the EMCV 2A gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-sumo to obtain the recombinant plasmid pET28a-EMCV-2A and confirmed by PCR and sequencing.The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).After ultrasound fragmentation,the expression of 2A protein was mainly in the form of inclusion bodies.By optimizing the protein expression conditions,the soluble expression of the target protein could be achieved.The recombinant protein was purified by beads and identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed.The molecular weight of the recombinant 2A protein was about 25 ku.The best condition was 16 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG,about 50% of the proteins were soluble.The purified recombinant protein was double-stained by SDS-PAGE and Western blotting,and indicated that the purified protein was the recombinant protein.The study provided the basic theoretical basis for elucidating the molecular pathogenesis of EMCV and preparation of gene vaccines and antiviral drugs.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

副猪嗜血杆菌rfaD基因的克隆及原核表达

rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096 株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927 bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50 ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。     

羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础.     

非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

试验旨在构建非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白（rEP153R）,并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列（GenBank登录号：FR682468.1）合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在16和37 ℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱－质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16 ℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱－质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

猪嵴病毒3C蛋白的原核表达及其结构分析

为获得猪嵴病毒3C蛋白并了解其晶体结构,本试验以中国西北地区猪嵴病毒swKoV CH441株RNA为模板,通过RT-PCR克隆出3C基因,将其连接到pMD19-T Simple Vector,通过PCR和双酶切鉴定后进行基因序列测定。选择测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其连接到pET-30a载体以构建重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,检测3C蛋白的表达情况。结果显示,本试验成功获得全长为576 bp的3C基因,可编码192个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组菌在37℃经0.5 mmol/L IPTG诱导6 h时重组蛋白表达量最高,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为28 ku。生物信息学分析结果显示3C蛋白为不稳定的非分泌蛋白,没有跨膜区,有多个磷酸化位点,主要参与蛋白水解过程,不同嵴病毒株间3C序列差异较大。3C蛋白作为小RNA病毒的共同裂解酶,在病毒复制、转录、翻译及多聚蛋白成熟过程中起着极为重要的作用。本研究成功构建了3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测为进一步制备猪嵴病毒3C蛋白晶体及研究其结构奠定了基础。     

PEDV COE基因重组乳酸菌在小鼠体内定植规律研究

选用pNZ8149-COE NZ3900重组乳酸菌作为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达载体,制成活菌制剂,口服免疫小鼠,以GFP基因作为标记跟踪重组菌在小鼠体内的定位,并利用荧光定量PCR技术对各部位菌定量分析。结果表明,研究构建的重组乳酸乳球菌PEDV-COE-GFP NZ3900可较长时间定植于胃肠黏膜表面,为基因工程重组乳酸菌口服疫苗的研究奠定了基础。