家蚕微孢子虫单抗金银染色法检测技术的研究

使用新构建的抗家蚕微孢子虫（N．b）的单克隆抗体,结合免疫金银染色（IGSS）,进行检测N．b。设计6种温度和5种时问,对N．b等9种微孢子虫检测,结果表明,该细胞株单抗直接IGSS法最佳工作条件：胶体金标记pH值6.2～6.5,金标抗体染色37℃、保湿30min,经显影后光镜观察,N．b孢子周边被染上棕褐色,其它类型孢子呈无色或浅褐色;实验还比较了抗原涂片后,不同物理、化学方法固定,结果甲醇固定效果较好。     

单抗免疫金银染色法诊断家蚕微孢子虫的研究

本文首次探讨了光镜水平的免疫金银染色法结合单克隆抗体技术鉴别家蚕微孢子虫,并就单抗免疫金银染色法的条件和特异性进行了摸索研究,结果认为:pH≤7.4,用丙酮固定,在室温下25℃染色10分钟或30℃染色5分钟,单抗免疫金染色法效果好,且对家蚕微孢子虫有很强的特异性。     

柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法

利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后,分别采用双抗夹心法和竞争法制作胶体金免疫层析试纸条,建立能简便、快捷、准确诊断柞蚕微粒子病的柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法。双抗夹心法和竞争法分别是将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与25 nm和17 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上,然后均将羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控点(C),但是2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的反应模式不同:前者是以柞蚕微孢子虫多克隆抗体作为检测点(T),而后者以柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为检测点(T)。2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的检测时间均为10 min,检测灵敏度为0.8×107个/mL,与柞蚕血淋巴无交叉反应,特异性强,操作简单,其中,以双抗夹心法制作的试纸条显色更清晰,结果更可靠,更具实用价值。     

柞蚕微孢子虫的研究进展

随着柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi Wen et Ding)cDNA文库及EST(expressed sequence tags,表达序列标签)测序的完成,基因克隆测序、功能蛋白分析、抗体免疫等研究手段也逐渐应用于柞蚕微孢子虫的研究,并在病原的分离检测、感染发病规律、传播途径、综合防治等方面取得较大进展。介绍了柞蚕微孢子虫的分离纯化与检测、感染传播规律及其分子机制的研究进展和柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕免疫应答的研究进展,展望了柞蚕微孢子虫的研究方向和内容。     

微孢子虫O-甘露糖糖基化通路相关酶基因序列的比较分析

糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。     

实时荧光定量PCR检测柞蚕微孢子虫的方法

提高柞蚕微孢子虫检测技术的准确性和灵敏度,对控制柞蚕微孢子虫的胚种传染至关重要。以柞蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(SSU rRNA)基因为靶基因,建立柞蚕微孢子虫的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法能够特异性检测柞蚕微孢子虫基因组DNA,而对柞蚕基因组DNA无扩增产物。依据标准曲线确定荧光定量PCR的Ct值≤35作为检测的敏感度区间,对柞蚕微孢子虫基因组DNA的最低检出限为0.004 6 ng。应用该方法对100粒柞蚕蛹样本进行检测,共检出54个样本呈柞蚕微孢子虫感染阳性,而采用普通显微镜镜检与采用常规PCR方法检测呈阳性的样本数量分别为2个和34个。应用该方法对生产中的柞蚕种茧和雌蛾进行抽样检测,柞蚕微孢子虫感染阳性检出率显著高于用普通显微镜镜检的阳性检出率(P0.05)。建立的柞蚕微孢子虫实时荧光定量PCR检测方法提高了检测的灵敏度。     

家蚕病原性微孢子虫极丝蛋白的研究

从家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,简称N .b)和蓝萤叶甲微孢子虫 (MPa)中抽提了极丝蛋白 (PTP) ,进行SDS PAGE分析。并选择性分离、纯化了N .b孢子中主要极丝蛋白 ,经氨银染色法鉴定其纯度较纯。将N .b孢子中该主要极丝蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 ,用酶联免疫法 (ELISA)测定其效价 ,滴度为 1∶10 2 40 0。利用制得的抗体进行胶体金标记免疫电镜定位观察 ,发现所纯化蛋白确实存在于极丝上。     

3种方法检测结核污染牛场的比较

应用牛结核变态反应、牛结核斑点免疫金银染色法(Dot—IGSS)和ELISA3种方法，同时检测结核污染牛场的498头份牛血清。结果发现，阳性检出率以变态反应为最高(28．3％)。Dot—IGSS居中(27．3％)，ELISA最低(17．2％)；变态反应与Dot—IGSS和ELISA的符合率较差，而ELISA和Dot—IGSS具有较好的符合率；在变态反应阴性牛中，仍然检出了部分Dot—IGSS和ELIsA阳性牛。由此认为，先以变态反应检疫牛群，再随之实施抗体检测，会更有利于结核污染牛场的净化与防制。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。     

野外昆虫与蚕种生产中的微粒子病防治

家蚕体内分离发现的 5种微粒子虫中 ,除家蚕微粒子虫 ( N osema bombycis)外未发现对家蚕具有较强致病性和胚传性的微粒子虫。野外昆虫中已有大量微粒子虫被发现 ,其中有些对家蚕也有很强的致病性和胚传性 ,但其原始寄主尚有诸多不明之处。所以 ,蚕种生产中防止野外昆虫微粒子虫对生产影响的根本途径在于控制家蚕微粒子虫污染的扩散和桑园治虫     

家蚕几种病原微孢子虫的比较研究

从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

不同容量母蛾样本检验微粒子灵敏度的测试

本试验通过用不同剂量的家蚕微粒子虫孢子感染5龄期家蚕幼虫，获得微粒子病毒蛾，并将这些有病蛾混入数量不等的未感染母蛾中，进行微粒子病检出率的测试，结果表明：在样本容量为180蛾时，检出率仍可达到现行生产要求的100%。     

破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验

蚕微粒子病检测技术是该病防治中的一项重要技术,本文在通过破碎法提高模板核酸获取量的基础上,对纯化家蚕微粒子虫孢子的PCR检测灵敏度进行了测试。提取核酸-模板稀释测试12对引物的灵敏度中有4对引物达到0．05粒（10^2粒/mL）、4对引物5粒（10^4粒/mL）、1对引物50粒（10^5粒/mL）、2对引物500粒（1...     

亚迪欣对家蚕病原体的消毒效果研究

亚迪欣是一种高效广谱性消毒药剂 ,对家蚕病毒病、真菌病、细菌病、微粒子病的病原体有显著的消毒效果。与常用的蚕用消毒剂蚕用消毒净比较 ,亚迪欣水溶液有效成分较稳定 ,对金属的腐蚀性较小 ;添食对家蚕的生长发育、茧质、丝质及种质未见不良影响。实际使用浓度为 2 5 0倍溶液用于蚕室蚕具消毒 ;10 0 0倍溶液用于桑叶叶面消毒。对细菌芽孢和毒素、微孢子消毒可用 16 0 0倍溶液     

桑尺蠖和丝棉木金星尺蠖的微孢子虫对家蚕病原性和胚种传染性研究

从桑尺蠖（ＨｅｍｅｒｏｐｈｉｌａａｔｒｉｌｉｎｅａｔａＢｕｔｌｅｒ）中分离的微孢子虫（简称桑尺蠖微孢子虫），形态为长卵圆形，大小为３．５～４．１×１．６～１．９μｍ。从丝棉木金星尺蠖（ＣａｌｏｓｐｉｌｏｓｓｕｓｐｅｃｔａＷａｒｒｅｎ）中分离的微孢子虫（简称丝棉木金星尺蠖微孢子虫），形状为卵圆形，大小为３．２～３．７×１．６～２．１μｍ。两种微孢子虫均能感染寄生家蚕的主要组织器官，引起蚕儿发病，但致病力要比家蚕微孢子虫（Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ）弱，且能经卵传染给下一代，其胚种传染率要比家蚕微孢子虫低。     

从家蚕蛾中分离的微孢子虫MZ_1(Nosema sp.)对家蚕的病原性研究

从养蚕生产的蚕蛾中分离到一种小型微孢子虫 ,暂名MZ1,其形状为卵圆形 ,大小为 2 49± 0 10 μm×1 32± 0 12 μm。寄生家蚕的大多数组织器官 ,在蚕体内的生殖发育圈与N .bombycis相似。对家蚕的致病力弱 ,ID50为每条蚕 172 5 0粒孢子 ,能在蚕体内经胚种传染给下一代。MZ1具有Nosema属的分类特征 ,初步定为Nosemasp .。     

带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法研究

为促进用PCR法检测家蚕微粒子病的生产应用,对带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法进行了研究。结果表明,蚕卵经30%KOH、27℃预处理后抽提的核酸能满足PCR检测对DNA质量的要求。以该方法抽提的DNA为模板,进行蚕卵集团检测,结果10~100粒蚕卵中混有1粒“有毒”卵,即能用PCR的方法检测出。“1/100”“有毒”卵的检出概率约为80%。