牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

奶牛边缘无浆体MSP2的原核表达及抗原性鉴定

为克隆和原核表达牛边缘无浆体(A.marginale)膜表面蛋白2(MSP2),并分析其免疫原性,本研究通过PCR方法扩增A.marginale的MSP2基因,将其连接到pGEX 6p-1载体中,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析,将纯化的MSP2重组蛋白免疫小鼠。结果表明表达并纯化了A.marginaleMSP2,其免疫原性良好,为制备单克隆抗体及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

牛分枝杆菌重组蛋白TB27.4的表达、纯化及活性鉴定

为探索TB27.4蛋白在牛结核病鉴别诊断中的作用,本试验以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增tb27.4全长基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-TB27.4,优化原核表达条件,并用AKTA Purifier对蛋白的纯化条件进行优化。SDS-PAGE结果显示重组蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,用牛分枝杆菌阳性血清进行Western blotting检测有特异性条带,且可特异性地刺激牛分枝杆菌感染牛外周血淋巴细胞释放大量IFN-γ。结果表明,重组蛋白TB27.4具有良好的B细胞活性和T细胞刺激活性,为进一步研究其在牛结核病诊断中的作用奠定了基础。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat6融合基因的分子克隆及表达

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a（＋）中获得重组质粒pET64-85b-e6。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1 mmol/L）进行诱导,SDS-PAGE电泳分析表达情况,以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western blot分析融合蛋白的免疫活性。结果表明：表达的融合蛋白大约为76 Ku,与预测大小相符,以Ni^2＋亲和层析柱纯化的融合蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌PE_PGRS62基因克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

为构建表达牛分枝杆菌(M.bovis)PE_PGRS62蛋白的重组耻垢分枝杆菌,本研究以M.bovis基因组DNA为模板PCR扩增PE_PGRS62基因,获得大小约为1 515 bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,将重组pMV-PE_PGRS62穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,42℃热诱导重组耻垢分枝杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的PE_PGRS62蛋白分子量约为60 ku,免疫印迹结果表明,表达的PE_PGRS62蛋白与兔抗M.bovis阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究M.bovis致病机理奠定了基础。     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

猪细小病毒NS1蛋白的表达与鉴定

为了获得具有良好免疫学活性的猪细小病毒(PPV)基因工程抗原,试验采用原核表达方法对猪细小病毒NS1蛋白进行了表达研究。结果表明:成功克隆了大小为1 389 bp的NS1基因主要抗原区域,经IPTG诱导获得了大小为60 ku、以包涵体形式表达的重组蛋白。利用6×His-Tagged Protein Purification Kit获得了高纯度的纯化蛋白,纯化蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,以纯化蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法与血凝抑制试验(HI)的符合率为97.92%。说明试验成功获得了体外表达的NS1重组蛋白,且重组蛋白具有良好的免疫学活性。     

胎儿弯杆菌表面蛋白(SapA)基因的分段表达及其免疫原性分析

应用PCR方法扩增出胎儿弯杆菌表面蛋白基因（SapA）的2个基因片段SapA-N（1398bp）和sapA—C（1422bp）,采用DNA重组技术,将2个基因片段分别连接于表达载体pET32a（＋）,并在大肠杆菌中诱导表达（rSapA—N和rSapA—C）,用金属鳌合层析的方法纯化蛋白。以Western blot检测重组蛋白的免疫学活性,ELISA试验分析2种蛋白用于胎儿弯杆菌病血清学诊断的可能性。结果表明,以可溶形式表达的2部分蛋白分子量大小约66ku,与预期大小相符。纯化的蛋白均具有良好的免疫学活性,但蛋白rSapA-N比蛋白rSapA-C的免疫学活性高,rSapA-N具有良好的胎儿弯杆菌病血清学诊断的应用价值。     

牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因的融合表达及其抗原活性鉴定

CFP-10和ESAT-6是牛分枝杆菌的免疫优势抗原,可诱导机体产生IFN-γ,在牛结核病的免疫诊断中发挥重要作用。本试验分别克隆了牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因,并将这2个基因融合扩增,构建重组表达质粒pET28a/CFP-10-ESAT-6,重组质粒在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。重组蛋白主要以分泌表达的形式存在于表达上清中,收集上清中的目的蛋白进行Ni亲和层析柱和分子筛两步纯化,蛋白纯度分别达到90%和95%。将纯化的重组蛋白以2mg/L的质量浓度包被酶标反应板,用间接ELISA方法检测不同来源牛血清中的结核病抗体,结果表明,表达的重组融合蛋白具有良好的抗原活性,可有效识别阴、阳性结核病血清。     

捕食线虫性真菌的分离鉴定

本文报道首次从我国内蒙古土壤中分离出一株捕食线虫性真菌,该菌株适宜在２０℃,ｐＨ６,玉米粉浓度０．４ｇ／Ｌ的玉米粉琼脂（ＣＭＡ）培养基中生长。通过对其菌丝、孢子及捕食性结构的形态学观察,鉴定其为节丛孢属的少孢节丛孢菌ＣＩＭＨＩ株（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ,ｓｔｒａｉｎＣＩＭＨＩ）。     

鸡胚法氏囊的组织发育

本试验通过对孵化至１３－２１日龄的鸡胚法氏囊进行组织学的连续性动态观察,较为详细地描述了早日龄鸡胚法氏囊的组织学分化发育过程。实验结果显示,直至出壳胶鸡胚法氏囊尚未形成较完整的能组织起 体液免疫促进作用的组织基础结构,其完善的形态结构需在后天环境中分化和发育。     

广西水牛类圆线虫病的病原体形态

类圆线虫病是广西水牛的常见寄生虫病之一,本文作者通过光镜观察,我们确认广西水牛类圆线虫病的病原体即为乳突类圆线虫。本文首次记述该虫种第四期幼虫的形态。在扫描电镜下,虫卵表面光滑,近似椭圆形。丝状蚴头端钝圆,口孔裂隙状,左右为2唇片,每唇片似分3小叶;体表两侧自劲部开始,各有2条纵嵴,延续至尾端,称为双翼膜(double alae),这是该期虫体独有的构造;丝状蚴尾端分叉。自由生活成虫具6片唇,各唇上有1个唇乳突;口孔内沿有一排锥状齿,共9枚;头端两侧各具1个半球形的头感器;头端背腹面的两侧各具1个头乳突,共4个,锥形。自由生活雄虫的泄殖腔处明显地突出于虫体表面,其周围有7对性乳突。自由生活雌虫的阴门横裂,肛门呈半月形。寄生生活雌虫头端截平,4个唇片由口缘伸向口孔,唇片近口孔中央向上翻卷,唇片上各有1个唇乳突;口孔呈倾斜(45°)的马耳他“十”字形;头感器1对,头乳突4个;阴门横裂,阴门部有1对阴侧感觉窝和1对阴后乳突;肛门横裂,突起;尾部自肛门后突然收缩,呈指状。在宿主体内未见到寄生生活雄虫。     

高剂量锌促进猪生长的机理探讨

选用42头“杜长大”三元杂交猪，分为2组（每组3个重复），分别饲以添加100mg/kg和3000mg／kg锌（氧化锌）的相同饲粮，进行了为期30d的饲养试验，然后屠宰取样，研究高剂量锌促进猪生长的作用机理。结果显示：饲粮中添加300mg/kg锌显著提高了日增重（P＜0.01)和采食量（P＜0.01）；饲料干物质、粗蛋白的消化率明显上升（P＜0.01）；肝脏组织中金属硫蛋白含量增加（P＜0.01），铜，锌－超氧化物歧化酶活力增强（P＜0.01);肝脏RNA含量和RNA／DNA值显著上升（P＜0.01）；血清胰岛素、胰岛素样生长因子I水平明显升高（P＜0.01）。试验结果提示，高剂量锌似通过有效清除体内自由基的不良影响，增强DNA转录RNA，促进胰岛素、胰岛素样生长因子I的合成和分泌，加强合成代谢，而产生促生长效果。     

完善我国动物保护的法律探究

动物物种灭绝危机促使人类加强对动物的关注和保护，西方国家有关动物保护的法律日渐丰富，但我国动物保护的法律工作远远滞后于动物保护的需要。因而有必要在剖析我国动物保护现存法律障碍的前提下，借鉴他国的立法启示，以期完善我国动物保护的法律方略。