犬瘟热弱毒疫苗免疫犬抗体消长规律及影响因素

应用犬瘟热病毒（ＣＤＶ）血清中和试验，对从日本引进的犬瘟热弱毒疫苗免疫犬的血清中和抗体效价进行了检测，探讨了免疫剂量、免疫程序和犬的年龄对抗体效价的影响。结果表明，试验犬于第１次免疫后１４ｄ左右产生１∶９以上的血清中和抗体，随后抗体水平迅速升高，３５ｄ时７８．３８％的免疫犬抗体效价超过１∶１００，６０ｄ达到高峰，６个月试验结束时，血清中和抗体效价仍维持在１∶１００以上。该犬瘟热弱毒疫苗的最低免疫剂量为１０３．０ＴＣＩＤ５０，以２周或３周间隔连续免疫３次均可使免疫犬获得完全保护。     

细菌CpG—DNA对犬免疫增强效果的研究

以犬瘟热病毒为模式病毒，将CpG-DNA与铝胶、蜂胶2种对照佐剂分别与犬瘟热病毒灭活疫苗配合，给犬接种疫苗前后用微量中和试验抽查血清中和抗体效价，根据抗体效价高低判断佐剂的免疫增强效果。结果表明，3种佐剂疫苗均能诱导产生特异性抗体，但组间抗体效价有显著差异（P＜0．01），CpG-DNA的免疫增强作用明显高于其它2种佐剂，CpG-DNA所诱导的抗体效价较蜂胶佐剂高5倍，较铝胶佐剂高7倍。     

山羊抗犬瘟热-细小病毒二联高免血清的研制

采用犬瘟热-细小病毒二联活苗结合它们的强毒组织灭活苗,经不同途径交替免疫成年山羊4次后,抗犬瘟热病毒血清中和抗体效价可达1:1024,抗犬细小病毒血凝抑制(HI)效价达1:2048。用该血清制剂对临床感染犬瘟热和病毒性肠炎的犬、貉、狐336余病例进行跟踪治疗,总有效率可达85％,治愈率为68％。本血清具有安全性好、特异性强、治疗效果可靠等优点。     

山羊抗犬瘟热—细小病毒二联高兔血清的研制

采用犬瘟热－细小病毒二联活苗结合它们的强毒组织灭活苗，经不同途径交替免疫成年山羊４次后，抗犬瘟热病毒血清中和抗体效价可达１：１０２４，抗犬细小病毒血凝抑制（ＨＩ）效价达１：２０４８。用该血清制剂对临床感染犬瘟热和病毒性肠炎犬，貉，狐３３６余病例进行跟踪治疗，总有效率可达８５％，治愈率为６８％，本血清具有安全性好，特异性强，治疗效果可靠等优点。     

犬细小病毒特异性抗血清的制备及应用研究

为制备犬细小病毒特异性抗血清,用犬细小病毒DD株免疫健康易感比格犬,无菌采血后分离血清制备犬抗CPV-2血清。通过SN、ELISA、IFA、HI方法对制备的血清进行检测,未检出犬类常见的5种病毒抗体,说明该血清特异性良好。经测定,该血清中和抗体效价为1∶512;HI效价为1∶1280。应用结果表明,该血清对不同犬细小病毒毒株中和能力相当,对CPV-2感染犬有良好的治疗效果。     

兔抗犬瘟热病毒高免血清的制备及反复冻融对其效价的影响

为制备犬瘟热病毒的高免血清及研究冻融次数对其效价的影响,笔者采用多次皮下免疫试验兔制备兔抗CDV高免血清,并将获得的血清反复冻融,以检测不同冻融次数对其中和抗体效价的影响。结果表明,按本试验的免疫程序获得的兔抗CDV血清中和抗体效价高且稳定;高免血清经反复冻融后浑浊度增加;当冻融次数达40次时,中和抗体效价出现明显下降。     

犬瘟热病毒抗体检测方法的比较研究

用犬瘟热（ＣＤ）弱毒和自制的高免犬血清，建立了检测犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗体的中和（ＳＮ）试验、间接荧光抗体技术（ＩＦＡＴ）和间接免疫酶染色法。这３种方法对３８份ＣＤ弱毒疫苗免疫犬血清抗体效价的测定结果表明，当被检血清稀释度为１∶１００时，ＳＮ试验、ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法测定时的阳性血清数分别为２９，７和３１份，ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法测定结果相对于ＳＮ试验结果的符合率分别为４２．１％和９４．７％。同时发现，当ＳＮ试验测定的血清效价在１∶１００以上时，ＩＦＡＴ测定结果总是在１∶２５以上，间接免疫酶染色法测定结果总是在１∶１００以上。３种方法以各自初步确定的ＣＤＶ血清抗体效价完全保护值指标计算所测血清的完全保护率，ＳＮ试验为７６．３％，ＩＦＡＴ为７８．９％，间接免疫酶染色法为８１．６％。据此认为，ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法均可部分代替ＳＮ试验用于ＣＤ疫苗免疫效果的评价、免疫犬抗体水平的监测以及ＣＤ的流行病学调查     

我国部分城乡犬狂犬病中和抗体水平调查

以国际兽疫局(OIE)推荐的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对随机采自广东、河北、北京等地区的573份犬血清进行了狂犬病病毒中和抗体效价的测定,以确定犬群中狂犬病的免疫状况。结果显示,在不同地区或不同城市的动物防疫区域中,犬体内狂犬病病毒中和抗体平均水平存在着明显的差异,城市犬的中和抗体水平较高,有的中和抗体保护水平(0.5IU/mL)阳性率高达100%,少数则达不到保护水平,不同防疫区域狂犬病中和抗体水平为(0.08±0.03)~(4.39±1.45)IU/mL,平均保护水平阳性率为46.3%;乡村看家犬病毒中和抗体水平普遍较低,大部分犬体内无中和抗体,只有个别犬体内存在水平较低的中和抗体,平均保护水平阳性率为1.8%。     

犬瘟热病毒DNA疫苗接种犬的免疫保护

用犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白基因(H、F)和核蛋白基因(N)重组质粒DNA和聚乙烯胺(PEI)混合后肌注10只3月龄CDV抗体阴性毕格犬,间隔30 d,共免疫3次,另选择5只犬作为阴性对照.免疫3次后,采用CDV攻毒.对照组呈现出犬瘟热的典型症状和组织病理损害,攻毒3周内,有2只犬衰竭死亡,1只犬症状明显,攻毒第18天外周血淋巴细胞中病毒RNA检测为阳性.DNA疫苗免疫组除出现一过性的体温升高外,未出现明显症状,攻毒后第18天外周血淋巴细胞CDV检测仍为阴性.DNA疫苗免疫后血清ELlSA抗体和病毒中和抗体测定显示,首免后机体激发的ELISA抗体滴度很低(101.25±0.615),二免后开始缓慢升高(101.69±0.285),再次免疫后达到102.051±0.214;中和抗体也呈现以上规律,三免后血清中和抗体为101.75±0.190,攻毒后血清ELISA抗体和中和抗体滴度迅速升高(103.02±0.202和102.41±0.245).试验表明CDV基因免疫对CDV的感染具有较好的保护作用,并能清除进入机体内的病毒.CDV基因免疫只激发较低水平的体液免疫,中和抗体在攻毒前达不到临界保护线(102),但对CDV攻击能产生较好的保护,推测其免疫效力可能源于细胞免疫和记忆性B淋巴细胞.     

自制貉源抗血清治疗犬瘟热病的研究

应用含有104.5TCID50/0.1 mL犬瘟热弱毒培养物4 mL免疫特种经济动物乌苏里貉,10 d后采集血液分离血清,病毒用200TCID50与等量连续倍比稀释的血清和经饱和硫酸铵粗提的免疫球蛋白做中和试验鉴定抗体的效价,并对上述2种抗体效价进行比较。结果表明,2917倍稀释全血清、2344倍稀释饱和硫酸铵粗提的免疫球蛋白能保护50%Vero细胞不出现CPE。临床应用全血清治疗24只患犬瘟热病的白貉,22只成活。由此说明可以应用狐貉等特种动物制备的抗血清治疗犬瘟热病。     

小熊猫接种犬瘟热弱毒疫苗的效果分析

使用荷兰英特威(intervet)公司生产的犬用犬瘟热(Canine Distemper)弱毒疫苗,接种了云南野生动物收容拯救中心、云南野生动物园和南京市红山森林动物园3处不同地点、不同饲养环境条件下的72只小熊猫,历时12 a,先后共接种302次,接种前所有小熊猫经过检疫、检查,无任何疾病,健康状况良好.抽检其中4只小熊猫作抗体变化测定,接种前中和抗体效价平均为1∶44,经犬用犬瘟热病弱毒疫苗接种后中和抗体效价提高到1∶1976,经多次接种试验,除1只发生不良反应出现死亡之外,其余接种的71只健康状况良好,多年来未发生犬瘟热病,通过此次试验,证明使用荷兰英特威公司生产的犬用犬瘟热弱毒疫苗接种小熊猫较为安全,中和抗体效价比接种前提高了45倍,有很好的免疫效果,是国内动物园预防小熊猫犬瘟热较为理想的疫苗.     

我国“貂瘟”、“狗瘟”病原分离、鉴定的研究

研究了我国的“貂瘟、狗瘟”病原。用敏感动物和鸡胚、犬肾单层细胞分离获得 HMDV、JMDV、LCDV 三株病毒。分离毒在鸡胚、犬肾、水貂睾丸,仓鼠肾等单层细胞上生长良好,产生病变具有付粘病毒“属”的特性。以法国犬瘟热弱毒苗及分离毒制备了阳性血清,作血清学病毒鉴定,病毒血凝和血抑效价1:320,血清抗体中和效价为1:160……,免疫前血清为1:20。本病毒属 RNA 病毒、不耐醚。电镜观察:病毒有囊膜和纤突、核衣壳呈螺旋对称型,病毒颗粒为132～175nm,位于细胞质内,其结构形态特点与美国犬瘟热弱毒Distemink.TC 株相类似。综合研究结果,鉴定本病毒为犬瘟热病毒,发生于我国的“貂瘟、狗瘟”定性为犬瘟热病。     

犬腺病毒（Ⅱ型）阳性血清的研制及应用

为研制犬腺病毒相关制品的检验用阳性血清,以健康易感山羊为免疫靶动物,深入优化免疫原和免疫程序,无菌采血后分离血清,并分装冻干。通过常规检验方法进行纯净性检测、特异性检测、抗体效价测定和中和指数测定,并将其应用于代表性的含犬腺病毒组分的活疫苗制品的外源病毒检验和鉴别检验等。结果显示,该批血清的纯净性检验和特异性满足要求,中和抗体效价为1∶9364,中和指数10~(6.0)。结果表明,该血清对犬腺病毒具有良好的中和作用,能够应用于犬腺病毒相关制品的外源病毒检验和特异性检验等,是兽用生物制品国家标准物质的重要候选标准品。     

麻疹疫苗对幼犬犬瘟热病毒母源抗体水平的影响

采用固定病毒稀释血清法,测定了不同日龄幼犬犬瘟热病毒(CDV)母源中和抗体效价。2、9、16和23 d幼犬平均抗体效价为1∶12、1∶24、1∶40和1∶22。幼犬23日龄时,分别接种CDV疫苗株、麻疹病毒(MV)疫苗株和正常Vero细胞培养物。结果发现,CDV疫苗株接种犬母源抗体于接种后14 d时仅为1∶6,而接种MV疫苗株和Vero细胞冻融物组CDV母源抗体未发生显著降低,接近1∶20的保护水平。本试验结果表明,当幼犬母源抗体效价为1∶20左右时,母源抗体可被CDV疫苗封闭,而MV疫苗株不受CDV母源抗体干扰。本文为临床应用MV疫苗接种幼犬,获得对CD交叉保护提供理论依据。     

犬细小病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

为获得可用于犬细小病毒(CPV)感染的治疗和快速诊断的单克隆抗体,从病料中分离了1株犬细小病毒,经PCR扩增VP1全基因并进行序列分析,确定为CPV-2 a型。再将VP1基因克隆到真核表达质粒pc DNA3中,构建了基因疫苗pc DNA3-VP1。用该基因疫苗免疫BALB/c小鼠3次后,取抗体效价高的两只小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA检测,结果获得了3株杂交瘤细胞株,该3株单抗与犬、猫细小病毒能发生反应,均不与犬瘟热病毒、流感病毒和犬腺病毒发生反应,诱生的腹水可体外中和犬细小病毒,其中两株单抗的中和效价为1∶256,1株单抗腹水的中和效价低于1∶128。结果表明,该CPV VP1基因疫苗可制备具有一定中和效价的CPV单克隆抗体。     

犬瘟热诊断技术

一、范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的操作方法。二、试剂和材料2.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基2.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)2.3磷酸盐缓冲液(PBS)2.4青霉素、链霉素2.5CDV阳性血清:中和抗体效价1·1024。2.6CDV阴性血清:无CDV感染的犬血清。     

犬瘟热病毒高压灭活疫苗的制备与应用

本试验用静水压高压灭活的方法对ＣＤＶ进行灭活,并加入蜂胶佐剂制备犬瘟热病毒高压灭活疫苗。将此灭活疫苗免疫接种ＣＤＶ易感犬,同时以用福尔马林灭活的犬瘟热病毒灭活疫功为对照,检测结果表明：犬瘟热病毒高压灭活疫苗安全、可靠,其诱导试验犬所产生中和抗体的能力明显高于该病毒的福尔马林灭活苗,临床应用证明该疫苗对犬的保护率达８９％。     

狂犬病病毒（Flury株）鸡胚低代毒（LEP）毒种的保存期试验研究及免疫原性测定

采用小鼠脑内接种法对保存不同年代的5批狂犬病病毒(Flury株)鸡胚低代毒(LEP)毒种进行病毒含量测定,并将每批毒种分别肌肉注射3月龄健康易感犬,21 d后采用小鼠脑内中和试验和荧光抑制试验分别测定犬血清抗体效价,评价毒种的免疫原性。结果显示,5批毒种每0.03 mL的病毒含量分别为104.67LD50、104.67LD50、103.5LD50、103.5LD50、104.17LD50;5批毒种免疫的10只犬血清抗体效价采用两种方法测定均达到1∶32以上,结果表明狂犬病病毒(Flury株)毒种在-70℃保存12年病毒含量仍符合标准规定,并保持有良好的免疫原性。     

犬传染性肝炎病毒单克隆抗体的研究 Ⅳ.Dot-ELISA检测犬传染性肝炎病毒抗体

本法建立的检测犬传染性肝炎病毒(ICHV)抗体的Dot—ELISA方法适用于流行病学调查时大量样品的检测。本法不与犬细小病毒阳性血清、犬瘟热病毒阳性血清交叉反应;与血清中和试验的阳性符合率为90.5％(19/21);有良好的重复性。是一种特异、敏感、简单、快速的检测方法。     

圈养大熊猫麻疹病毒易感性流行病学调查

成都大熊猫繁育研究基地对圈养的7只8～21岁的大熊猫血清犬瘟热病毒(CDV)中和抗体滴度进行了测定.结果显示,尽管这些大熊猫自2003年起每年接受2次CDV弱毒疫苗接种,该弱毒疫苗是由未知家犬犬瘟热病毒株制作的,大熊猫血清犬瘟热病毒中和抗体滴度却在2×到256×的较大范围内(平价值=16)波动.通常单次的麻疹病毒弱毒疫苗注射足以导致宿主产生相应的稳定的免疫反应,在大熊猫上抗犬瘟热中和抗体变化幅度较大提示在宿主与疫苗的关系中存在某种程度的不足.