犬瘟热病毒重组H蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测水貂犬瘟热病毒(CDV)血清抗体的间接ELISA方法,将CDV的血凝素蛋白(H)基因的主要抗原表位片段克隆至p ET-30a-c(+)载体中,转化至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。以纯化的重组H蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法,并证实该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。采用建立的方法与国外商品化的犬瘟热抗体检测试剂盒对80份血清进行检测,两者符合率为92.5%。本研究建立的间接ELISA方法为水貂抗体水平检测和评价犬瘟热疫苗免疫效力提供了简便快速的方法。     

犬瘟热病毒检测方法研究进展

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起犬的一种急性、高度接触性传染病.该病的流行严重危害犬及毛皮动物养殖业的健康发展,且对濒危物种保护造成严重威胁.因此,准确、快速检测CDV感染是有效防控疫病传播的关键技术手段.论文介绍了CDV基因组结构、犬瘟热流行病学特点和临床症状,综合论述了CDV检测方法的研究进展,包括病毒分...     

犬瘟热的研究进展

犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的高度接触性传染病,危害极大。CDV结构蛋白的一些特性决定着它的感染力,同时其细胞受体也在感染中起关键作用。CDV感染引起动物上皮细胞、淋巴细胞病变和神经系统损伤,由此出现犬瘟热特征性症状。CDV血清学检测是当前临床上最常用、最主要的确诊方法,分子生物学诊断方法也越来越显示出很多     

水貂犬瘟热病毒RC01株和细小病毒RC02株的分离鉴定及攻毒保护试验

取某水貂养殖厂疑似犬瘟热病毒和细小病毒混合感染病料,采用犬瘟热抗原快速检测试纸、HA和PCR、RTPCR法检测CDV和MEV。分别以抗CDV和抗MEV阳性血清中和后接种敏感细胞进行蚀斑纯化,成功分离一株细小病毒(MEV-RC02株)和犬瘟热病毒(CDV-RC01株)。将纯化后的MEV-RC01株和CDV-RC01株分别回归本动物,结果显示,分离株均具有较强的致病性。将水貂犬瘟热(CL08株)、病毒性肠炎(NA04株)二联活疫苗免疫健康非免貂后进行攻毒保护试验,结果表明,该二联疫苗对分离的MEV-RC02株和CDV-RC01株流行毒株具有很好的保护作用。     

犬瘟热病毒间接免疫酶组化检测方法的建立

为对犬瘟热病毒(CDV)进行组织定位检查,本实验利用犬瘟热抗CDV单克隆抗体(MAb),采用间接免疫酶组化法对6只人工感染的比格犬肠组织的病毒抗原进行定位检测。结果表明,利用犬瘟热抗CDV MAb建立的间接免疫酶组化方法具有较高的特异性和灵敏性,可原位检测病犬肠组织中CDV抗原的分布,其抗原的阳性表达主要在小肠绒毛和李氏隐窝的上皮细胞胞浆内,表明CDV主要侵害小肠的粘膜上皮组织。     

犬瘟热的研究进展

犬瘟热是由犬瘟热病毒（CDV）引起的高度接触性传染病,危害极大。CDV结构蛋白的一些特性决定着它的感染力,同时其细胞受体也在感染中起关键作用。CDV感染引起动物上皮细胞、淋巴细胞病变和神经系统损伤,由此出现犬瘟热特征性症状。CDV血清学检测是当前临床上最常用、最主要的确诊方法,     

犬瘟热病毒DNA疫苗接种犬的免疫保护

用犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白基因(H、F)和核蛋白基因(N)重组质粒DNA和聚乙烯胺(PEI)混合后肌注10只3月龄CDV抗体阴性毕格犬,间隔30 d,共免疫3次,另选择5只犬作为阴性对照.免疫3次后,采用CDV攻毒.对照组呈现出犬瘟热的典型症状和组织病理损害,攻毒3周内,有2只犬衰竭死亡,1只犬症状明显,攻毒第18天外周血淋巴细胞中病毒RNA检测为阳性.DNA疫苗免疫组除出现一过性的体温升高外,未出现明显症状,攻毒后第18天外周血淋巴细胞CDV检测仍为阴性.DNA疫苗免疫后血清ELlSA抗体和病毒中和抗体测定显示,首免后机体激发的ELISA抗体滴度很低(101.25±0.615),二免后开始缓慢升高(101.69±0.285),再次免疫后达到102.051±0.214;中和抗体也呈现以上规律,三免后血清中和抗体为101.75±0.190,攻毒后血清ELISA抗体和中和抗体滴度迅速升高(103.02±0.202和102.41±0.245).试验表明CDV基因免疫对CDV的感染具有较好的保护作用,并能清除进入机体内的病毒.CDV基因免疫只激发较低水平的体液免疫,中和抗体在攻毒前达不到临界保护线(102),但对CDV攻击能产生较好的保护,推测其免疫效力可能源于细胞免疫和记忆性B淋巴细胞.     

犬瘟热病的临床诊断及其病原的分离与鉴定

为了对疑似犬瘟热病例进行临床诊断与确诊,试验应用犬瘟热病毒(CDV)胶体金抗原检测试纸检测板进行检测,对死亡犬进行病理剖检,取肝脏、脾脏、肺脏、胃肠道及淋巴结等病料研磨匀浆,接种Vero细胞,观察细胞病变并应用RT-PCR技术检测感染细胞中病毒基因特异性片段。结果表明:病料接种Vero细胞24 h后出现细胞融合、形成空斑、细胞变圆及脱落等细胞病变(CPE);经RTPCR检测,扩增出病毒基因特异性片段,片段大小为335 bp。说明Vero细胞对CDV表现出良好的敏感性,是体外分离培养CDV的一个有效细胞系。     

犬瘟热病毒在Vero细胞上培养条件的优化研究

犬瘟热病毒(CDV)在Vero细胞上增殖条件研究结果表明，血清含量5％，2倍的细胞密度，24h接毒，48～96h有利于CDV的增殖。     

荧光抗体技术在犬瘟热诊断中的应用

犬瘟热是犬的重要传染病之一。本病临床表现不一,危害严重,因此及时确诊对控制其发生和传播十分重要。本文应用犬瘟热病毒(CDV)荧光抗体(FA)技术,对某犬群流行的犬瘟热进行了诊断,现报告如下。材料和方法一、CDV荧光抗体:Bioveta Nitra公司制,工作浓度1:26。二、免抗CDV阴、阳性血清:本室制     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒免疫原性测定

为测定表达犬瘟热病毒(CDV)H基因的重组犬2型腺病毒(CAV-2/CDVLPH)免疫原性,25只45-50日龄犬(抗CDV中和抗体小于1∶2,CAV-2 HI抗体效价小于1∶2)随机分为5组进行免疫犬试验,第1组为CAV-2/CDVLPH免疫组,第2组为pVAXLPH免疫组,第3组为pVAXLPH和CAV-2/CDVLPH联合免疫组,CDV弱毒疫苗组和pVAX1空载体组分别作为阳性和阴性对照组。利用间接ELISA和CDV中和试验检测免疫犬的抗CDV体液免疫水平、CAV-2 HI试验检测免疫犬的抗CAV体液免疫水平、淋巴细胞转化试验检测免疫犬的抗CDV和抗CAV-2细胞免疫水平,分析CAV-2/CDVLPH的免疫性。结果,能够在各试验组免疫犬血清中检测到抗CDV ELISA抗体和抗CDV中和抗体,同时在第1组和第3组免疫犬的血清中检测到抗CAV-2的HI抗体,免疫犬的外周淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显增殖,第2组的免疫应答水平低于第3组,第1组又高于第3组,但低于CDV弱毒疫苗免疫组,试验表明CAV-2/CDVLPH可同时诱导免疫犬产生抗CDV和CAV特异性免疫,CAV-2/CDVLPH与pVAXLPH相比能诱导犬产生较高的特异性免疫应答,然而低于CDV弱毒疫苗。     

犬瘟热病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立犬瘟热病毒(CDV)的一步法RT-PCR检测方法,并将其应用于临床实践检测。本研究根据GenBank上已登录的CDV基因序列,设计一对特异性引物,建立CDV一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CDV感染的早期诊断和病原监测。     

水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV3-CL株,悬浮培养)临床安全性和免疫效力评价

为评价水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV3-CL株,悬浮培养)冻干制剂在临床应用中的安全性和免疫效果,分别在吉林、辽宁两省选择饲养规模相似的3个毛皮兽场进行疫苗安全性(10头份)和免疫效力实验(1头份)研究,接种后观察动物的临床症状,检测抗体水平并随机选择部分水貂进行攻毒试验。结果显示,超剂量接种水貂未见有明显的临床症状,对水貂的生产性能无明显影响;水貂免疫疫苗后21 d即可获得达到免疫保护的抗体水平;免疫180 d仍能维持较高水平的抗体,且能够保护动物抵抗强毒攻击。试验表明,水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV3-CL株,悬浮培养)冻干制剂具有较好的临床保护效果。     

青海省犬瘟热病的血清学调查

犬瘟热(canine distemper)是由犬瘟热病毒(ca-nine distemper virus,CDV)引起的犬科、鼬科动物及部分浣熊科动物的高度接触性、致死性传染病。近年来随着养犬数量的增多,致使犬瘟热日趋流行,危害日渐严重。为掌握犬瘟热病毒感染情况,2006年7月笔者在青海省西宁、乐都、格尔木、德令哈等县(市),采集未经免疫的犬血清142份进行了感染检测。1材料与方法1.1诊断试剂北京世纪元亨公司生产的犬瘟热病毒抗体诊断试剂盒。1.2待检血清西宁、乐都、格尔木、德令哈4县(市)犬血样142份。采集后摆成斜面,放在室温待血清析出后收集血清,-20℃冷冻保存待…     

犬瘟热病毒一步RT-PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核蛋白(N)基因的相对保守区序列设计了1对特异性寡聚核苷酸引物,在国内首次建立了CDV一步RT-PCR检测方法。该法可以特异地扩增出N基因265 bp大小的目的片段,可以检测到0.043 6μg/mL的总RNA,与两步法RT-PCR的敏感性相当。对25例犬瘟热临床疑似病例样品,一步法RT-PCR检测出17份阳性,与两步法RT-PCR的阳性符合率达94.4%,胶体金检测试纸条检测出13份阳性。研究结果表明,建立的CDV一步法RT-PCR检测方便、敏感、特异,适用于CDV临床病料的检测和分子流行病学调查。     

犬瘟热病毒融合蛋白、血凝蛋白、基质蛋白和核衣壳蛋白基因DNA联合免疫的研究

为研究犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)、基质膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)基因核酸联合免疫的效力,本研究分别构建了表达经哺乳动物密码子优化的CDV F、H、M和N蛋白基因的真核重组表达质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM和p CAGG-CDVN;将其分别转染BHK-21细胞后通过间接免疫荧光试验表明,目的蛋白均获得正确表达。此外,将等量混合的重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM(3组份DNA疫苗)或重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM、p CAGG-CDVN(4组份DNA疫苗),分别以500μg/只经肌肉注射途径免疫A组(6只)或B组(6只)比格犬,间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次,并于初次免疫前、后不同时间检测血清CDV中和抗体。中和试验结果显示,A组和B组免疫犬,二免4周时,CDV中和抗体滴度平均值达到峰值,分别为6 log2和5.64 log2;在初免54周时,CDV中和抗体滴度均仍然维持5 log2。因此,3组份DNA疫苗为具有良好应用前景的犬瘟热候选疫苗。     

水貂病毒性肠炎杆状病毒载体灭活疫苗与水貂犬瘟热活疫苗混合免疫效果评价

为评价水貂病毒性肠炎杆状病毒载体灭活疫苗(简称MEV亚单位疫苗)与水貂犬瘟热活疫苗(简称CDV活疫苗)混合免疫的效果,本研究将两种疫苗混合后在室温静置不同时间测定犬瘟热病毒(CDV)含量,并选用30只健康水貂随机分为6组进行比对试验,其中G1和G2组免疫MEV亚单位疫苗稀释CDV活疫苗的混合疫苗,G3组为CDV活疫苗单独免疫组,G4组为MEV亚单位疫苗单独免疫组,G5和G6组分别为CDV攻毒组和MEV攻毒组。免疫后21 d采血检测CDV中和抗体,同时对G1、G3、G5组进行CDV攻毒;免疫后14 d采血检测MEV血凝抑制(HI)抗体,同时对G2、G4、G6组进行MEV攻毒。结果：两种疫苗混合后在室温静置2 h, CDV含量无明显下降。免疫后21 d, G1和G3组CDV中和抗体效价达到1∶64.6～1∶128.8,CDV攻毒后混合疫苗和CDV活疫苗免疫组的保护率均为100%。免疫后14 d, G2和G4组的MEV HI抗体效价达到1∶128～1∶1 024,MEV攻毒后混合疫苗和MEV亚单位疫苗免疫组的保护率均为100%。研究表明,MEV亚单位疫苗稀释CDV活疫苗,混合免疫后各疫苗的免...     

犬瘟热弱毒株CDV3生物学特性鉴定

以SPF鸡胚成纤维细胞 (CEF)从国外引进的疫苗中分离到犬瘟热弱毒株CDV3 。对犬瘟热弱毒株CDV3 的理化特性 ,细胞病变规律 ,病毒毒价 ,核酸型、血清学交叉反应 ,试验动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验 ,结果表明 ,犬瘟热弱毒株CDV3 可作为狐犬瘟热疫苗生产用毒种。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备和鉴定

将从水貂中分离的犬瘟热病毒(CDV) HB株,以培养纯化的犬瘟热病毒HB株免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗犬瘟热病毒结构蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.3株单克隆抗体菌属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1∶51 200和1:204 800,细胞培养上清液效价可达到1:256和1:512.ELISA分析表明,单抗仅与CDV发生特异性反应,而与犬细小病毒(CPV)和犬腺毒(CAV)没有交叉反应;荧光免疫染色检测进一步表明单克隆抗体的特异性好.该特异性单抗的制备为建立有效检测犬瘟热病毒感染的方法奠定基础.     

稳定表达水貂SLAM受体BHK-21细胞系的建立及初步应用

为了建立易于犬瘟热病毒(CDV)培养增殖的细胞系,试验采用BHK-21细胞为亲本细胞,将表达水貂信号淋巴细胞激活分子(SLAM)的真核表达质粒pDisplay-mink SLAM转染到细胞中,通过G418压力筛选并结合有限稀释法等方法成功构建出稳定表达水貂SLAM的单克隆细胞系BMS,并采用间接荧光免疫和PCR等方法进行初步鉴定。结果表明:应用该细胞系可有效提高CDV分离效率,并成功分离得到山东诸城水貂、狐狸CDV各1株。