弓形虫P3O基因及其功能

弓形虫P30基因所编码的蛋白为弓形虫主要表面抗原SAG1,其约占速殖子总蛋白量的5%,SAG1对虫体侵入宿主细胞及其毒力具重要性,并有高度免疫原性和免疫保护性,被用于弓形虫疫苗的研制和弓形虫感染的 分子诊断.     

弓形虫P30基因及其功能

弓形虫 P30基因所编码的蛋白为弓形虫主要表面抗原 SAG1 ,其约占速殖子总蛋白量的 5 %,SAG1对虫体侵入宿主细胞及其毒力具重要性 ,并有高度免疫原性和免疫保护性 ,被用于弓形虫疫苗的研制和弓形虫感染的分子诊断     

弓形虫4个假定蛋白基因缺失株的构建及其基本生物功能学研究

旨在探究4个与MIC相关的假定蛋白在弓形虫速殖子阶段的作用及基因缺失对毒力的影响。在线设计TGME49_222975、TGME49_275798、TGME49_238220和TGME49_238210的sgRNA序列,用PCR将pSAG1：：CAS9-U6：：sgUPRT模板上的sgUPRT突变为相应的sgRNA,获得目的基因的CRISPR质粒。将获得的目的基因质粒和DHFR片段混合后电转入弓形虫速殖子,经乙胺嘧啶单克隆筛选后,PCR鉴定成功即得目的基因缺失株。再用目的基因缺失株和RH野生株进行复制、逸出、噬斑和小鼠毒力试验,比较二者各项试验结果,以评定目的基因对于弓形虫速殖子功能和毒力的影响。结果显示：目的基因缺失株和野生株RH在相同时间内形成的含有1、2、4、8、16个速殖子的纳虫空泡数占比差异不显著（P>0.05）,纳虫空泡内速殖子在钙离子刺激下2 min内均可全部逸出,相同条件和时间培养形成的噬斑大小和面积差异不显著（P>0.05）,接种相同数目速殖子的小鼠自开始死亡到全部死亡时间差别不显著（P>0.05）。本研究成功构建了4个弓形虫MIC相关基因的缺失株（RHΔTGME49_222975、RHΔTGME49_275798、RHΔTGME49_238200和RHΔTGME49_238210）,但毒力与野生株毒力均差异不显著,说明这4个基因均不是弓形虫的重要“独立”毒力因子,但可能在其他方面发挥着重要的生物学功能。本研究初步解析了4个弓形虫MIC相关蛋白的基本生物学功能,为后期全面解析弓形虫蛋白功能提供数据。     

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。     

不同保种时间及复苏代次弓形虫对小鼠致病性研究

为了评价液氮冻存不同时间后及在小鼠体内复苏不同代次的弓形虫速殖子感染小鼠致病性的研究,通过比较感染处理后的弓形虫小鼠健康及存活状况,筛选出更佳的液氮冻存时间和合适复苏代次,对于建立小鼠急性弓形虫感染模型及弓形虫致病机理等具有重要意义.通过腹腔注射不同保种时间(2、4、6月)和不同复苏代次(1、2、3代)弓形虫速殖子,观...     

脂酰辅酶A合成酶抑制剂Triacsin C对弓形虫速殖子体内增殖抑制效果的观察

为明确脂酰辅酶A合成酶抑制剂Triacsin C对弓形虫速殖子是否具有体内抑制效果，本试验将不同质量浓度的Triacsin C灌服小鼠，并以磺胺嘧啶和阿奇霉素作为参考，后将弓形虫RH株速殖子(2×10⁵个)腹腔感染给药组小鼠，以小鼠的存活时间、腹腔中速殖子数量、肝脏中弓形虫核酸的拷贝数和主要脏器的病理损伤作为指标，观察Triacsin C对弓形虫的体内抑制效果；同时对不同药物质量浓度下不感染弓形虫的小鼠进行组织病理学观察。结果显示，8×10^-2 g/L Triacsin C能够显著抑制速殖子的增殖，小鼠的存活时间也相应延长，低剂量下(1×10^-2,2×10^-2 g/L)抑制效果不显著，感染组小鼠肝、脾、肺、肾均出现明显的病理损伤，并在192 h内死亡；给药未感染弓形虫的小鼠脏器未见有明显病理变化。结果表明，高剂量的Triacsin C具有体内抑制弓形虫速殖子增殖的能力，且对宿主主要脏器不产生病理损伤。     

弓形虫速殖子与弓形虫缓殖子相互转换的研究进展

弓形虫速殖子与缓殖子的相互转换,在弓形虫病的研究中具有重要的作用。本文阐述了弓形虫缓殖子及包囊的形成因素,速殖子与缓殖子的差异、缓殖子特异性蛋白,并就IFN-γ与弓形虫速殖子和缓殖子相互转换的关系、在速殖子与缓殖子相互转换中可能存在的信号途径、在速殖子与缓殖子之间是否存在中间体等方面的研究进展加以综述。     

浅谈猪弓形虫病诊断与防制

1 病原学 龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)属真球虫目(Eucoccidiida)艾美亚目(Eimeriina)弓形虫属(Toxoplaxma).弓形虫在发育的不同阶段,形态各异,在中间宿主人和各种动物(包括猫)的各种组织细胞中有速殖子和包囊两种形态,在终末宿主猫的肠上皮细胞内有裂殖体、配子体和卵囊三种形态.     

氟康唑抗弓形虫速殖子作用的超微结构观察

为探讨氟康唑在体外杀灭弓形虫速殖子的效果,抽取感染弓形虫RH株速殖子小鼠腹水,选择活跃的速殖子并稀释至含虫密度为1×105个/m L,加入氟康唑溶液使其终浓度为1.5 mg/m L,以未加药物的相同腹水作阴性对照,加入阿奇霉素的作为阳性对照。应用透射电镜观察药物作用1小时、4小时时虫体超微结构的变化并拍照。结果表明:随着氟康唑作用时间的延长,弓形虫速殖子超微结构逐渐遭到破坏,细胞内容物外溢,最终崩解死亡。相同时间内阿奇霉素作用的速殖子出现细胞膜结构受损,速殖子从头、尾两端开始断裂。说明氟康唑在体外可以杀死弓形虫速殖子,达到了和阿奇霉素一样的效果,且效果与时间有关。     

弓形虫病的免疫诊断学研究进展

弓形虫是人兽共患的细胞内寄生原虫病,危害大,分布广,为动物源性疾病,呈世界性分布,无论人和动物感染率都很高,据报道许多国家和地区人群感染率为25％~50％,高者达80％以上。由于感染部位不同,临床表现复杂确诊困难,并严重危害人畜健康,给畜牧业造成巨大的经济损失。随着生物学技术的发展,目前对表面抗原的研究已深入到基因水平,本文就近几年来弓形虫表面抗原的研究现状综述如下。1 抗原1.1 速殖子表面抗原 速殖子是弓形虫侵入机体导致发病的主要形式,速殖子表膜是宿主免疫系统识别并杀伤虫体的主要部位,弓形虫速殖子表面蛋白P22,     

人畜共患弓形虫病的防治

正弓形虫病是由龚地弓形虫(或刚第弓形虫)寄生于多种哺乳动物和人的多种有核细胞中引起的一种寄生虫病。一、病原及生活史弓形虫为细胞内寄生虫,根据其发育阶段不同,可分为速殖子和假包囊、慢殖子和包囊、裂殖体和裂殖子、配子体和卵囊五个阶段,各阶段形态不一。在弓形虫的生活史中,猫是唯一的终末宿主,也是中间宿主之一。人、猪、牛、羊、鼠和禽类等都可作为中间宿主。如带有脑包囊的小鼠被猫捕获,包囊被猫吞食后,囊壁即在胃和     

犬猫弓形虫抗体检测及临床治疗

正刚地弓形虫是一种猫科动物的肠道球虫,最初由法国学者发现,因其外形非常像"弓",故命名为"刚地弓形虫"。我国学者首次于1957年从动物体内分离得到,并通过不断研究,于1970年证实猫为其最终宿主。通常寄生在人、犬、猫等有核细胞内,为人畜共患病。1弓形虫生活史弓形虫的发育经历5个阶段:滋养体(速殖子、缓殖子)、包囊、裂殖体、配子体和卵囊。很多哺乳动物为其中间宿主,猫及猫科动物是其     

弓形虫在猫科动物小肠上皮细胞内发育过程的研究进展

猫科动物是弓形虫的终末宿主,可排泄弓形虫卵囊。本文综述了弓形虫缓殖子、速殖子和卵囊感染猫科动物的效率,整理了弓形虫缓殖子在猫小肠上皮细胞内的无性和有性生殖各阶段的结构特点,无性发育阶段裂殖体的特点,从而有助于进一步了解弓形虫的发育过程,为弓形虫的保存、传代、疫苗及致病机制研究提供参考资料。     

磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子抑制消减文库的构建和初步分析

为了研究和探索磺胺氯吡嗪抗弓形虫的作用机理,构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫的抑制性消减文库.将刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子腹腔注射(10000个/只鼠)感染昆明系小鼠,大量收集并纯化速殖子.用250 mg/mL磺胺氯吡嗪PBS溶液和PBS分别浸泡速殖子,37℃恒温箱孵育2h,分别提取虫体的总RNA和mRNA,以PBS处理的正常虫体cDNA为驱动组,以药物处理虫体cDNA为实验组,构建药物处理前后弓形虫速殖子的抑制性消减文库,对部分阳性克隆进行测序和序列分析.结果显示,提取的虫体总RNA纯度高,合成的双链cDNA经RsaⅠ酶切反应较完全;从消减文库中随机选择100个阳性克隆进行PCR扩增,其插入片段长度在200～750 bp之间,文库的重组率达93％以上;随机挑取30个阳性克隆进行测序,获得11个单一序列,Blast分析显示有7个单一有效EST序列与已知蛋白质相似性较高.结果表明,已成功构建磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子的抑制性消减cDNA文库,并对部分阳性克隆进行了初步分析,为深入研究磺胺氯吡嗪的抗弓形虫机制和寻找药物作用的关键靶分子奠定了基础.     

弓形虫胶体金免疫层析试纸条的研制

为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,获得SAG重组表位抗原,Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用r SAG重组蛋白及r SPG分别划线,作为检测线和质控线,制作胶体金免疫层析试纸条,利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白,且该重组蛋白具有较好的免疫原性。以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条,能够快速检测弓形虫的阳性血清,为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。     

犬新孢子虫和刚地弓形虫超微结构的比较

使用透射电镜，对从犬获得的三株犬新孢子虫分离株的感染培养细胞的速殖子超微结构进行检查。三个分离株的超微结构相似，速殖子具有一个表膜、２２个表膜下微管、一个类椎体，前后均有极环，８—１２个电子致密对式细胞器、大量微丝、一个单在泡状核、管状线粒体、高尔基复合体、核糖体、内质网、一个无活性的微孔、电子致密体、脂质体和技链淀粉体。大多数速殖子寄生在靠近宿主细胞核寄生性空泡中，它含有大量内空泡管。速殖子以内出芽形式分裂。没有观察到犬新孢子虫组织包囊。犬新孢子虫和刚地弓形虫的速殖子可根据对式细胞器的结构和数量、微丝和电子致密体的数量和位置予以区别。     

弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定

本研究旨在构建弓形虫(Toxoplasma gondii)Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2(membrane occupation and recognition nexus protein,MORN2)基因敲除株,探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物,以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板,在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒;在MORN2靶点两翼约500bp设计同源臂引物,以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因(DHFR)的同源片段;将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中,进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示,试验成功获得MORN2基因敲除株,在体外噬斑试验中,该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致;在体内感染试验中,分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠,小鼠的死亡时间与对照组基本一致,说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能,为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。     

PCR检测猪弓形虫病方法的建立

为了探索以p30基因的部分序列作为模板进行猪弓形虫病PCR检测的最佳条件,根据弓形虫p30基因序列设计引物进行PCR扩增,结果出现预期的扩增片段484bp,该PCR方法最低能检测到5个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的2种寄生虫无交叉反应,具有高度的敏感性和特异性。     

羊弓形虫病间接ELISA诊断方法的建立

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,用于检测弓形虫特异的IgG抗体.研究结果表明:除BAG1外上述4种...     

弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究

为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。