半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

贝莱斯芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

本实验利用PCR方法扩增1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)源的内切葡聚糖酶基因(CMCase),插入到p ET32a(+)中构建重组表达大肠杆菌系统,对重组内切葡聚糖酶基因进行生物信息学分析以及酶学性质研究。结果表明:内切葡聚糖酶由499个氨基酸组成,预测分子量为55.02 ku,最大开放阅读框ORF约为1 500 bp。经诱导表达优化后,培养上清中可检测到内切葡聚糖酶酶活力为5.81 IU/mL,菌体中为1.61 IU/mL,诱导后原菌液直接超声破碎处理可达7.41 IU/mL,其酶活力为野生菌株的2.3倍。重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征,其最适酶反应温度和pH分别为50℃和6,在60℃条件下放置1 h相对剩余酶活力可保持在70%以上,在pH 6～10范围内可保持90%以上。Na~+、Mg~(2+)可以促进重组内切葡聚糖酶酶活力,而Co~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(2+)等金属离子以及表面活性剂SDS则具有较强的抑制作用。由此可见,本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了内切葡聚糖酶,且该酶主要进行分泌表达,具有一定的耐热性和良好的pH稳定性。     

家蚕表皮酪氨酸酶和漆酶的分离纯化及酶学鉴定

酚氧化酶是昆虫黑化反应的关键酶类。采用硫酸铵分级(20%～30%、40%～65%饱和度)沉淀以及ConA Sepharose4B亲和层析和Sephacryl S-200凝胶过滤的方法,从家蚕蛹表皮样品中分离纯化出酪氨酸酶和漆酶,2种酶的比活力分别达到2 900、1 343 U/mg。经非还原SDS-PAGE电泳和酶学动力学特性分析表明:家蚕表皮酪氨酸酶的分子质量约80 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物酪氨酸和邻苯二酚染色呈现棕褐色条带,该酶与2种底物的米氏常数(Km)分别是16.8 mmol/L和12.5 mmol/L,最适pH分别是6.5和7.5,最适温度均是30℃;家蚕表皮漆酶的分子质量约44 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物2,2'-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)染色呈现蓝绿色,而用酪氨酸染色颜色没有变化,该酶与底物ABTS的Km值是32.7 mmol/L,最适pH 5.0,最适温度50℃;酪氨酸酶的热稳定性比漆酶高。研究结果表明,采用硫酸分级沉淀、亲和层析和凝胶过滤方法能从家蚕表皮中分离纯化出漆酶和酪氨酸酶,酶学动力学分析二者对催化底物的特异性有差别,推测它们在家蚕表皮的硬化和黑化过程中发挥不同生理作用。     

副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶的原核表达与活性检测

克隆表达副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC),并测定其酶学特性。以副猪嗜血杆菌SH0165菌株基因组为模板,将BgaC基因的序列(1 791bp)克隆到pET32a质粒上,并电转化BL21表达菌株。以His标签融合蛋白纯化操作方法纯化表达产物。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定β-半乳糖苷酶的天然分子质量,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷为底物测定其酶学特性。结果表明,在大肠埃希菌BL21中成功表达了副猪嗜血杆菌的BgaC基因,经鉴定pET32a+BgaC重组菌表达的蛋白大小为82.4ku。纯化后BgaC的酶比活力为1 795U/mg,pET32a+BgaC重组蛋白的最适pH为6~7,最适温度为30℃~37℃。副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC)具有糖苷酶活性能够介导糖蛋白的降解,在氨基酸序列上存在高度保守的区域,在生物技术领域具有广泛的应用前景。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

家蚕孵化酶样基因BmHEL的原核表达及蛋白纯化与功能鉴定

孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长BmHEL质粒DNA为模板,用PCR方法分别获得了该基因的开放阅读框(BmHELORF,885bp)、缺失信号肽编码区(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能编码区(BmHELb,624bp)的3个片段,并亚克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行表达。表达的3种外源蛋白均以包涵体形式存在,获得含有6×His-Tag标签的融合蛋白,其分子质量分别为33.4、31.8、24.0kD。通过Westernblot方法检测到了用Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白。纯化复性后的3种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHELORF的活性最高,BmHELb的活性最低。在pH7.1反应条件下3种酶的活性比pH9.5时高。研究结果在蛋白质水平上进一步证实家蚕孵化酶样蛋白参与了蚕卵孵化这一重要生命过程。     

青藏高原低温纤维素降解菌的筛选与酶学特性

以青藏高原冷地早熟禾草地土壤为样品,筛选低温纤维素降解菌株。采用刚果红染色法(水解圈法)和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法进行菌株筛选与酶学特性研究,结合形态学与分子生物学方法对其进行鉴定。筛选出一株低温纤维素降解菌株(LD19),经鉴定为钉斑链霉菌(Streptomyces clavifer),同时该菌还具有降解半纤维素的能力。该菌产纤维素酶的最适温度为40℃,最适pH值为6,在30～70℃、pH值4～10时相对酶活力较稳定,Zn~(2+)对酶有抑制作用。该菌产半纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH值为6,在30～40℃、pH值4～9时相对酶活力较稳定,Cu~(2+)等对该酶有促进作用。该菌株在培养102 h后两种酶的相对酶活力均达到最高值。菌株LD19可以同时分泌低温纤维素酶和半纤维素酶,在饲用酶制剂的应用中具有较大潜力。     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测

Cecropin-XJ是一种从家蚕幼虫体内分离纯化的具有很强热稳定性、酸碱适应性和广谱抗菌性的新型家蚕抗菌肽。以融合不同标签的表达载体构建pET28a-Cecropin-XJ、pET30a-Cecropin-XJ、pET32a-Cecropin-XJ、pMAL-p2X-Cecropin-XJ重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度等条件,通过对目的蛋白表达的检测分析,选择、建立Cecropin-XJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的技术体系。试验结果表明:采用构建的重组原核表达载体pET32a-Cecropin-XJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达产物形式存在,可溶性蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的Cecropin-XJ融合蛋白纯度可达90%以上。体外抑菌试验显示Cecropin-XJ融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清     

家蚕病原白僵菌原生质体分离条件的研究

调查研究了家蚕病原白僵菌（Beauveriabassiana）原生质体的分离制备条件。以6mg／mLDriselase液为酶解液，以0.7mol／LNaCl液（pH5．8）为渗透压稳定剂，在30℃下轻轻振荡处理1．5h，能从家蚕病原白但菌嫩菌丝中分离出2～4×107个／mL原生质体，这是家蚕病原白鹰菌原生质体的最适分离条件。     

丝素蛋白膜作为葡萄糖氧化酶载体的研究

采用戊二醛共价交联法将葡萄糖氧化酶（GOD）固定在丝素膜上，探讨了酶的固定化方法，研究了固定化酶膜的动力学性质，并与包埋法制备的酶膜进行了比较。共价法可获得高活力的酶膜（534u／cm2），固定化过程中使用甲醇或戊二醛处理对酶活力有轻微影响。固定化GOD最适pH值向中性偏移（pH7．0），最适温度为50℃，热稳定性提高，表观米氏常数比溶液酶降低，酶膜的贮存稳定性良好。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

不同温度下5种拟除虫菊酯类农药对家蚕的毒性变化

拟除虫菊酯类农药对昆虫的毒性具有温度效应。采用食下毒叶法测定5种常用拟除虫菊酯类农药在环境温度35、30、25、20℃时对家蚕的急性毒性。随着温度的升高,5种拟除虫菊酯类农药对家蚕的急性毒性降低,在35℃时溴氰菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯对家蚕2龄幼虫的LD50值与20℃时的LD50值的比值分别为7.63、12.27、8.49、2.76、1.75。研究结果表明,5种拟除虫菊酯类农药对家蚕的急性毒性表现为负温度效应,其中氰戊菊酯对家蚕的毒性受温度的影响最为明显,溴氰菊酯和联苯菊酯较为明显,高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯的毒性受温度影响较小。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。