鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2基因的克隆与生物信息学分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。     

柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的克隆、序列分析及重组表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)细胞色素bc 1复合物(cytochrome bc1,Cytbc1)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据EupathDB已公布的E.tenella Houghton株Cytbc1基因序列(Contig ID:ETH 00007855)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtCytbc1基因序列,并将其克隆到表达载体pCold43a中,构建重组质粒pCold43a-EtCytbc1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,EtCytbc1的ORF序列(687bp),编码228个氨基酸;重组菌pCold43a-EtCytbc1能成功诱导表达,pCold43a表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的克隆、序列分析与原核表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,G6-PI)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据NCBI已公布的E.tenella Houghton株G6-PI的基因序列(GI:298161921)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtG6-PI基因序列,并将其克隆到表达载体pColdI、pCold43a中,构建重组质粒pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,E.tenella G6-PI的ORF序列(1650 bp),编码550个氨基酸;重组菌pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI均能成功诱导表达,其中pCold43a-EtG6-PI表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与鉴定

提取柔嫩艾美耳球虫(扬州株)配子体基因组DNA,PCR扩增配子体基因Etgam56,经克隆和序列分析后,优化密码子,连接至pET-28a(+),构建原核表达载体pET-28a(+)-Etgam56,优化条件进行体外诱导表达,Western blot分析其抗原性。结果显示,Etgam56基因全长1 425 bp,为一个完整开放阅读框,共编码474个氨基酸;体外表达重组蛋白的大小约为56 ku,IPTG终浓度为0.10 mmol/L,37℃诱导3 h时的表达量最高,且主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、柔嫩艾美耳球虫鸡康复血清和毒害艾美耳球虫鸡康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。本研究将为进一步探析柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫基因工程疫苗奠定基础。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

柔嫩艾美耳球虫MAGL基因的克隆及表达

酰基甘油酯酶(MAGL)是将酰基甘油分解为甘油和游离脂肪酸的丝氨酸水解酶家族成员之一,在酯代谢中起着关键酶的作用,是研制抗鸡球虫药物的重要靶标。本研究利用生物信息学技术预测拼接了柔嫩艾美耳球虫MAGL基因序列,以第二代裂殖子总RNA为模板,通过RTPCR技术获得Etmagl基因。将Etmagl与pCold-43a载体连接,构建pCold-43a-Etmagl重组载体,并在大肠杆菌BL21中获得可溶性蛋白,经亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果显示,扩增的Etmagl序列ORF长1 752 bp,编码584个氨基酸,与预测序列相似度为99%,与弓形虫MAGL相似度好(55%);IPTG诱导后融合蛋白高效表达,大小约为114 ku,经免疫印迹鉴定为目的蛋白。本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了柔嫩艾美耳球虫酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶标的抗球虫药物筛选模型奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) SO7重组酵母蛋白的表达及其免疫保护效果,试验用E.tenella的保护性抗原基因SO7与鸡IL-2基因串联在毕赤酵母表达载体pPICZαA中进行表达,用Western-blot检测表达是否成功。分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并以1×10~4个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫,观察免疫保护效果。结果表明:诱导后的重组酵母全菌蛋白pPICZαA-SO7-IL2成功表达;两种蛋白抗球虫指数(ACI)分别为175.48,174.35,说明pPICZαA-SO7-IL2对感染鸡只具有较高的抗球虫效果。     

柔嫩艾美耳球虫两种表面抗原基因的原核表达与鉴定

为进一步研究柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白,应用RT-PCR从柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子总RNA扩增表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233),与pGEM-T easy载体连接,扩增目的片段后分别双酶切扩增产物与pET-28a(+),连接转化至BL21后,诱导表达,分别获得两种重组蛋白。SDSPAGE结果表明,两种重组蛋白的分子质量均为32ku,为包涵体蛋白形式。分别以感染柔嫩艾美耳球虫的鸡血清和重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体作为一抗,经Western blot分析,结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。通过对这两种表面抗原基因的研究,为基因工程疫苗的研究提供一定的理论依据。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达与鉴定

参照已发表的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增长约972 bp的E基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。     

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

水泡性口炎病毒糖蛋白主要抗原决定区片段基因的原核表达和纯化

参照GenBank中水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增约为810bp的G基因片段,并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体上,将经PCR、酶切鉴定以及测序分析正确的阳性重组质粒命名为PGEX-G810,之后将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3),经IPTG进行诱导表达;表达产物经SDS-PAGE、Western blotting等方法进行检测。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为60 000;包涵体经变性、复性、Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后,分离得到复性的融合蛋白。纯化的融合蛋白能与VSV阳性血清发生特异性免疫反应,证明表达的目的蛋白具有良好的抗原性。     

鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定

本实验对E．tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM—T,转化感受态菌DH5仅,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．5％。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3—1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47、024％。     

柔嫩艾美耳球虫BJ株Et1A基因的克隆及序列分析

本文参照已发表的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)折光体蛋白基因序列,根据其阅读框及载体序列特点,两端分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点设计引物,以E.tenellaBJ株的总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,成功扩增出Et1A基因。将PCR产物与pGEM-T载体连接后,转化JM109感受态细胞,蓝白斑法筛选阳性克隆并测序。测序表明,该基因全长1978bp,其阅读框大小为1944bp;与GenBank登记的Et1A基因相比较,有6个部位、共7个碱基发生了突变,其中5个有意义突变,2个无意义突变,同源性达99 5%。与堆型艾美耳球虫(E.acervulina)的Ea1A基因的同源性为79 3%,而与牛艾美耳球虫(E.bovis)的同源性只有19 5%。表达产物具有核苷酸转氢酶的功能,推测可为子孢子侵入宿主细胞提供能量。     

兔出血症病毒主要结构蛋白基因的克隆、原核表达及其免疫原性鉴定

本试验采用RT-PCR方法扩增了兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后,进行序列测定,将测序正确的纯化产物双酶切,克隆入原核表达载体pET28b(+)中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta^TM,用IPTG诱导培养重组表达菌。经SDS-PAGE分析,在分子质量62.0 ku处可见明显的表达带,经Western blotting检测,约在62.0 ku处出现特异性的反应带。结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC-2基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。     

布鲁氏菌Omp25的表达及抗原性分析

克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析.以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566 (DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性.将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中.将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566 (DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白.Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性.结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性.本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础.     

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。     

柔嫩艾美耳球虫泛素蛋白功能初步研究

泛素是真核生物中普遍存在的一种小分子蛋白,广泛参与细胞内蛋白质的平衡代谢过程,对维持细胞内环境的稳态具有重要作用.为研究泛素在柔嫩艾美耳球虫中的功能,本研究利用PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫泛素(EtUb)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21,诱导表达制备rEtUb蛋白,用纯化的重组蛋...