鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)B细胞抗原表位,本研究将IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白作为免疫原,交叉免疫BALB/c小鼠,制备了1株抗IBV N蛋白的单克隆抗体(MAb)6D10。Westernblot结果表明该MAb可特异性的识别IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株和重组N蛋白。同时利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白抗原表位进行筛选,获得11个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这11个克隆均展示有"FGPRTK"6个氨基酸的序列,对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸残基。同时,通过人工合成其编码序列并进行原核表达,利用MAb6D10对表达产物进行western blot分析,反应性良好。由此表明"FGPRTK"6肽为IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株的一个线性B细胞抗原表位。表位的保守性分析结果表明,本研究鉴定的表位在各种血清型IBV毒株中均高度保守。本研究结果为进一步研究IBV N蛋白抗原的结构和功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为鉴定鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗原表位,本研究将IBV tl/CH/LDT3/03株免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆筛选,得到两株针对IBV核(N)蛋白的单克隆抗体(MAb)6H3和6F9,其染色体数目分别为90条和102条,MAb亚类鉴定分别属于IgG1和IgG2b,轻链均为κ链。对MAb6H3和6F9的抗原表位进行初步鉴定,将N基因分成8个片段克隆于pGEX-6p-1载体中,转化BL21(DE3)内诱导表达。经western blot分析,MAb6H3表位的初步定位在aa80～aa99,而MAb6F9表位的初步定位在aa64～aa82。而且MAb6F9还能特异性识别其他5株IBV的天然N蛋白,推测它们含有一个相同的B细胞表位。     

抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为建立抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的单克隆抗体(MAb),利用浓缩的IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ F115病毒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法,经筛选和克隆后获得了一株抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞系(2D2).经鉴定,其MAb的重链为lgG<.1>亚型,轻链为κ链.ELISA和westernblot试验结果表明,所获得的这株2D2 MAb可特异性识别IBV N蛋白.2D2 MAb可与多种血清型IBV发生反应,表明该MAb识别的表位可能位于N蛋白的保守区域.为进一步鉴定IBV的表位及诊断试剂的研究奠定了基础.     

利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的VP8蛋白抗原表位,本研究采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株针对IBRV的VP8蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为1F5和3C2。MAb1F5和3C2的腹水效价均大于1:4×10~5,亚型均为IgG1/κ。间接免疫荧光试验表明,2株MAb与IBRV呈特异性反应。利用肽扫描技术对MAb进行抗原表位鉴定,结果表明MAb3C2的抗原表位为~(138)PHRSLLERTA~(147),MAb1F5的抗原表位为~(183)GGGQEPG~(189),2株MAb针对的抗原表位在不同的IBRV分离株中高度保守。本研究为VP8蛋白的结构与功能的进一步分析及IBRV的检测奠定了基础。     

猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白VP1的单克隆抗体(MAb)及鉴定其表位,本研究以原核表达的重组VP1-E蛋白(aa427~aa524)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞;以纯化的FCV-2280病毒粒子作为检测抗原,采用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型、中和活性及所识别的抗原表位等。结果表明,获得两株稳定分泌抗FCV VP1-E MAbs的杂交瘤细胞E2F1和E2F6,抗体均为IgG1亚型,轻链为κ链。杂交瘤细胞分泌的抗体无中和活性。Western blot结果显示,两种抗体可以特异性识别FCV-2280,表明其针对的抗原表位为线性表位。两株MAb识别VP1-E序列均为~(467)YICGSLQRAWG~(477)。生物信息学分析显示该抗原表位在FCV VP1蛋白中相对保守。该MAb为建立特异性强、灵敏度高的FCV的检测方法奠定基础。     

蓝舌病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备抗蓝舌病病毒(BTV)15型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达并纯化的重组VP2蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白的MAb(2D6)。通过western blot和间接免疫荧光试验对该MAb进行特异性鉴定。结果显示,其仅能够识别BTV15,而不能识别其他血清型BTV以及同种属的中山病毒和茨城病毒,表明该MAb具有良好的反应特异性。利用肽扫描技术对该MAb针对的B细胞表位进行鉴定,确定该MAb识别的抗原表位为15IAPAIIK RYP24。本研究为BTV15特异性抗原检测方法的建立奠定了基础。     

蓝舌病病毒3型VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备血清3型蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用pMAL-C4x原核表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV3 VP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(3F2)。间接免疫荧光结果表明:MAb 3F2与BTV3、BTV5、BTV9、BTV16呈阳性反应;与BTV6、BTV7、BTV13、BTV21呈弱阳性反应;与其它BTV血清型均呈阴性反应。利用原核表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合短肽对MAb 3F2识别的抗原表位进行鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为89PGERGIQMKIKEIEEE104。氨基酸序列比对结果显示该表位在不同地域来源的BTV3株间比较保守。该MAb的制备和鉴定为进一步研究VP5蛋白的结构和功能奠定了基础。     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒核蛋白单克隆抗体的制备及其线性抗原表位鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)单克隆抗体(MAb),本研究用腺病毒表达的CDV截短N蛋白(aa401~aa523)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合并筛选到2株能够稳定分泌抗CDV N蛋白的MAb,命名为N1-C8和N1-C41。经间接ELISA测定N1-C8和N1-C41培养上清液及小鼠腹水效价分别为1∶1 024、1∶106和1∶512、1∶105。通过肽扫描的方法筛选出N1-C8的抗原表位为线性表位~(440)ENQGGDKYPIHFNDE454,但并未能够筛选出N1-C41的抗原表位,推测可能是因为其抗原表位为空间构象型。Western blot结果显示N1-C8和N1-C41两株MAb在识别CDV的不同毒力病毒株上有差异,可能与CDV强弱病毒株在N蛋白的差异变化有关。本研究两株MAb的制备为CDV不同毒力株的鉴别诊断提供了可能。     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。     

IgM单抗体内,外杀伤日本血吸虫的研究

本文报道应用急性感染日本血吸虫的Ｂａ１ｂ／ｃ小鼠脾细胞和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，获得了一株具有抗血吸虫攻击感染保护作用的ＩｇＭ单抗ｓｓｊ１４。在被动免疫转移试验中，这株单抗在小鼠体内提供了２７．６９％～６８．５％的减虫率。体外ＡＤＣＣ试验显示该单抗参与了巨噬细胞和嗜酸性粒细胞介导的杀伤血吸虫童虫的作用，免疫化学特性测定表明该单抗同时对血吸虫尾蚴、成虫和虫卵三期虫体抗原起反应，靶抗原的分子量为２９０ＫＤ，分别位于血吸虫童虫和成虫的表膜及虫卵的卵壳。靶抗原表位的化学性质为多糖类，它同时被辐照致弱尾蚴免疫的大鼠血清、血吸虫慢性感染人血清和小鼠血清所识别。本文结果表明，ＩｇＭ抗体和多糖类抗原在血吸虫病免疫保护作用中发挥了重要的作用。     

Epitope mapping of a monoclonal antibody against the Gp85 of avian leukosis virus subgroup J

Avian leukosis virus subgroup J poses a great threat to the poultry industry in China. To reduce the economic losses, a quick method for detection of ALV-J antigen is required for diagnosis and identification of the congenitally transmitting hens. In this study, we report the production and evaluation of one monoclonal antibody (MAb) suitable for achieving these goals. The gp85 gene of avian leukosis virus subgroup J CAUHM01 China isolates was subcloned into the expression vectors pGEX-6p-1 and pET28a and successfully expressed in E. coli. After immunizing BALB/c mice with recombinant His-Jgp85 protein, splenic cells from immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells to produce hybridomas. We isolated and characterized one ALV-J gp85-specific MAb by determining its titer, affinity and IgG subclass. In addition, we performed epitope mapping and determined the epitope for the MAb 1E3 to be 81-92 aa of ALV-J gp85 protein (LPWDPQELDILG). Bioinformatics analysis and IFA studies revealed that this epitope is conserved among all ALV-J isolates and that this antibody could serve as a useful reagent for ALV-J detection and diagnosis.     

具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。     

禽传染性喉气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gD的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达gD重组蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经细胞融合筛选获得一株稳定分泌抗ILTV gD蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚型经鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够识别ILTV。ILTV gD蛋白的MAb的制备,为ILTV检测方法的建立奠定了基础。     

应用假病毒和假型病毒制备抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体的初步研究

为制备抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体(MAb),本实验以表达CSFV E2囊膜糖蛋白的水泡口炎假病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合;利用间接ELISA方法和携带荧光素酶(Luciferase)报告基因的HIV-luc/CSFV-E1E2假病毒系统筛选分泌中和性E2MAb的杂交瘤细胞;测定MAb亚型并纯化后,间接ELISA方法测定MAb的效价;采用western blot鉴定MAb的特异性亲和力;利用HIV-luc/CSFV-E1E2假病毒进行体外中和试验,分析MAb抑制病毒感染的能力。结果表明本实验获得了1株分泌中和性MAb的杂交瘤细胞9C8,该MAb能与E2蛋白特异性结合,而且体外抑制试验中和效价大于1∶25600。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

A recombinant chimera composed of repeat region RR1 of Mycoplasma hyopneumoniae adhesin with Pseudomonas exotoxin: in vivo evaluation of specific IgG response in mice and pigs

Using the binding and translocation domain of Pseudomonas exotoxin A [domain III deleted PE termed PE(ΔIII)] as a vehicle, this study characterized and evaluated a novel application of PE toxin in Mycoplasma hyopneumoniae adhesin used as an immunogen. PCR and sequence analysis revealed that 16 copies of AAKPV(E) in tandem repeat region 1 (RR1) of M. hyopneumoniae 97 kDa adhesion were successfully fused to the downstream of PE(ΔIII) to create a subunit vaccine, i.e. PE(ΔIII)-RR1. This chimeric protein, over-expressed in inclusion bodies of E. coli BL21(DE3)pLysS, was characterized by a monoclonal antibody (MAb) F2G5 prepared against RR1 of the 97 kDa adhesin and was readily purified. The data indicated that the epitope recognized by MAb F2G5 was located in the structure of PE(ΔIII)-RR1. Using ELISA and Western blot analyses, the specific IgG immune response against RR1 and whole adhesin in mice immunized with PE(ΔIII)-RR1 was found more marked than that in mice immunized with the M. hyopneumoniae whole cells. Similarly, PE(ΔIII)-RR1 also stimulated a remarkable IgG response against RR1 in pigs compared to that in pigs immunized with the conventional M. hyopneumoniae vaccine. The PE(ΔIII)-RR1 would be potentially useful for the future development of a M. hyopneumoniae adhesin vaccine.     

Foot-and-mouth disease virus C3 Resende subtype analysed by means of competition RIA using neutralizing monoclonal antibodies.

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) was analysed using 30 monoclonal antibodies (MAbs) obtained from Balb/c mice immunized with FMDV C3 Resende (C3R) subtype 7 and 14 days before fusion No. 15 and 16 respectively. Fourteen MAbs were neutralizing and by means of competition radioimmuno assay it was possible to classify them into four groups. The first group consisted of MAbs specific for three sequential and three conformational epitopes. The second group consisted of MAbs specific for two conformational and for one sequential epitope. The third and the fourth groups consisted only of one MAb each, being specific for conformationally and one sequentially dependent epitope, respectively.