表达猪瘟病毒E2蛋白的复制型水疱性口炎假病毒的拯救

为拯救囊膜表面携带有猪瘟病毒E2蛋白的复制型水疱性口炎假病毒,共转染分别表达水疱性口炎病毒核衣壳蛋白、磷蛋白、聚合酶蛋白以及携带有猪瘟病毒E2基因的复制型水疱性口炎病毒载体于BHK-21细胞中.采用Western blot、间接ELISA以及体外微量中和试验检测和鉴定拯救的假病毒.结果显示,E2蛋白成功地在BHK-21细胞中表达,假病毒VSV/CSFV-E2免疫的Balb/c小鼠血清中有高滴度的抗E2抗体,假病毒诱导产生的抗体在体外可以有效的阻断猪瘟病毒囊膜蛋白E1和E2蛋白假型的病毒HIV-luc/CSFV-E1&E2对PK-15细胞的感染.     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。     

鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备

本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在...     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性单克隆抗体(MAb),用含有BVDV E2基因的真核表达质粒pcDNA-E2免疫4周龄～6周龄BALB/c鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以BVDV作为抗原建立间接ELISA筛选及4次连续克隆获得3株能稳定分泌抗E2MAb的杂交瘤细胞系,分别命名为2E2、3D12、4D6。MAb亚类鉴定表明,2E2和4D6为IgM类,3D12为IgG2a亚类,轻链均为κ链。经western blot和间接免疫荧光检测证明3株MAb针对E2的构象表位,并且3D12株MAb能与BVDV及猪瘟病毒(CSFV)结合,2E2和4D6MAb只能与BVDV结合。     

一株H1N1亚型猪流感病毒血凝素HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌抗H1N1 SIV HA蛋白的MAb杂交瘤细胞株(10H8)。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG2a。MAb 10H8细胞上清和腹水的IPMA效价分别为11 024和151 200,腹水血凝抑制(HI)效价为13log2。Western blot试验结果显示MAb 10H8能够特异性地结合HA蛋白。病毒中和试验结果显示MAb 10H8杂交瘤细胞培养上清原液和1640稀释的腹水均能够抑制H1N1亚型SIV感染细胞,对SIV具有较强的中和活性。HA蛋白合成多肽的dot-blot鉴定结果显示,MAb 10H8识别的线性抗原表位为295KCQTPHGALKGNLPFQ310。本研究为H1N1亚型SIV诊断试剂和新型疫苗研发奠定了基础。     

马传染性贫血病毒基质蛋白p15单克隆抗体的制备

为制备抗马传染性贫病毒(EIAV)的单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的重组EIAV基质蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了抗EIAV基质蛋白p15抗体的杂交瘤细胞.应用重组p15和EIAV总蛋白为抗原建立的ELISA以及EIAV感染细胞的间接免疫荧光法,对杂交瘤细胞进行了有限稀释法筛选,获得了7株稳定分泌抗p15抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:1F12、1E2、1E3、4B10、4H7、5E5、4G5.这些抗p15 MAb均能与感染驴胎皮肤细胞的EIAV和经SDS-PAGE分离的EIAV总蛋白中的相应蛋白结合.抗体效价叠加实验表明,这7株MAb中含有至少3种识别不同抗原决定簇的抗体.这些p15 MAb的获得有助于对EIAV和慢病毒的深入研究.     

细胞表面荧光免疫吸附法在猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤筛选中的应用

为验证细胞表面荧光免疫吸附法(CSFIA)筛选高活性杂交瘤细胞的效果,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒(PEDV)重组N蛋白为免疫原,免疫6周龄～8周龄的BALB/c雌性小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,分别采用CSFIA和间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,并检测目的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体(MAb)效价。结果显示,CSFIA筛选的MAb 1B1比间接ELISA筛选的MAb 3D3抗体效价高10倍,并且通过观察荧光强度能够实现杂交瘤细胞的一次性筛选,无需多次亚克隆,周期缩短约30 d。本研究表明CSFIA在筛选杂交瘤细胞中具有简单、直观和高效的优点,是一种值得推广的快速制备MAb的新方法。     

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

鸡SIgA重链单克隆抗体的制备及新城疫病毒和禽流感病毒特异黏膜SIgA检测方法的建立

为建立快速检测禽类黏膜组织中SIgA含量的方法,本研究原核重组表达鸡SIgA重链片段蛋白,纯化后免疫BALB/c鼠.以鸡胆汁中分离纯化的SIgA作为检测抗原,常规单克隆技术筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体(MAb)的IgG2a、κ型MAb.经ELISA和western blot分析,所获得的1株MAb亲和力高、特异性强;采用生物素标记纯化MAb腹水IgG为检测二抗,以禽流感-新城疫重组二联活载体疫苗免疫SPF鸡为模型,初步建立了新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒特异的黏膜SIgA间接ELISA检测方法.本研究为开展特异性家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段.     

A common neutralizing epitope on envelope glycoprotein E2 of different pestiviruses: implications for improvement of vaccines and diagnostics for classical swine fever (CSF)?

The Pestivirus genus within the family of Flaviviridae consists of at least three species; classical swine fever virus (CSFV) found in swine and wild boar, bovine viral diarrhoea virus type 1 and type 2 (BVDV-I and BVDV-II) mainly isolated from cattle and border disease virus (BDV) preferably replicating in ovine species. Many features demonstrate differences between CSFV and other pestiviruses, BVDV-I, BVDV-II and BDV, here defined as nonCSFV, whereas other features show similarities between all different species of pestiviruses. Focussing on the major envelope glycoprotein E2, the immunodominant protein of pestiviruses, CSFV seems to be a more distinct species within the Pestivirus genus. Here we confirm on one hand the more separated grouping of CSFV by isolation of monoclonal antibodies (MAbs) raised against E2 of BVDV-I and BVDV-II. None of these MAbs recognize E2 of CSFV strains. On the other hand, only one MAb, MAb 912, was isolated against E2 of BDV. MAb 912 binds to E2 of CSFV strains and partly neutralizes CSFV. The epitope of MAb 912 is mapped in antigenic domain B of CSFV-E2. This common epitope of CSFV strains and nonCSFV strains could have implications for development of DIVA vaccines and serological diagnostics for CSF.     

抗H3N2亚型猪流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)尿囊液作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗SIV-H3N2的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价可达1×106。通过抗体亚型测定,间接免疫荧光试验及免疫印迹试验分析鉴定,该7株单抗均为抗H3N2亚型SIV的特异性单克隆抗体,而且与其他亚型猪流感病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等均无交叉反应,为H3N2亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

Development and Optimization of Indirect ELISA Detection Method of Classical Swine Fever Virus Antibody

In this study,through a series of screening and optimization of reactions condition,an indirect ELISA method was developed for detections the antibodies against classical swine fever virus (CSFV) with the purified recombinant CSFV E2 protein.The results showed that the optimal concentration for coating antigen was 1.0 μg/mL and incubated at 37 ℃ for 1 h.The proper serum sample was diluted by 1:200 and the sealing time was 37 ℃ for 1 h.Enzyme labeled second antibody was diluted by 1:10 000 and the reaction time was 45 min incubating at 37 ℃.The D450 nm<0.30 of sample defined as negative of CSFV antibody in the serum sample.The intra-batch and inter-batch variation coefficients were 4.8% and 6.9%,respectively.It indicated that the method in this study had a high stability.Specific test showed that the indirect ELISA had no crossing reactions with the antibodies against PRV,PRRSV,PCV and PPV.80 serum samples were detected in this study,the positive coincidence rate of indirect ELISA was 83.58%,the negative coincidence rate was 76.92%,and the total coincidence rate was 80.25% compared to the results of import blocking ELISA kit.The results suggested that the established indirect ELISA method in this study had an excellent clinical application.