嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0.07～0.60不等的商品猪,9头猪随机分为4组,1组(3头)肌肉注射免疫103.5TCID50的PCV1-2/头,2组(2头)肌肉注射真核表达质粒200μg/头,3组(2头)肌肉注射空载体(pcDNA3.1)200 μg/头,4组(2头)不免疫作为攻毒对照组.于免疫后42 d,PCV1-2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体.免疫后42 d所有组攻毒PCV2和PRRSV,剂量分别为2×104.5TCID50/头和106TCID50/头.攻毒后21 d,攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大,免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒载量低于对照组,攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组.这些结果表明,嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后,对PCV2感染能产生保护性免疫应答,有可能成为候选疫苗.     

猪圆环病毒2型灭活疫苗最小免疫保护剂量研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,疫苗是防制该病的主要手段.为研究PCV2灭活疫苗的免疫效果,本研究将PCV2 SH株灭活,用生理盐水稀释成5×105.0TCID50/mL(高剂量)、2.5×1050 TCID50/mL(中等剂量)、1.25×105.0 TCID50/mL(低剂量)、6.3×104.0 TCID50/mL(超低剂量)4种剂量,与等量白油佐剂乳化后,通过断乳仔猪的免疫攻毒试验观察该灭活疫苗的免疫特性.结果表明,PCV2疫苗抗原含量大于1.25×105.0 TCID50/mL时免疫仔猪后均可以产生特异性抗体,能够明显减轻攻毒后仔猪的临床症状、缓解组织病变、降低病毒血症,对免疫猪有一定的保护效果,可以作为预防PCV2感染的疫苗使用.本研究为研制商品化的PCV2灭活疫苗提供实验依据.     

嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及真核表达质粒pcDNA3．1／V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0．07～0．60不等的商品猪,9头猪随机分为4组,1组（3头）肌肉注射免疫10^3.5 TCID50的PCV1-2／头,2组（2头）肌肉注射真核表达质粒200μg／头,3组（2头）肌肉注射空载体（pcDNA3．1）200μg／头,4组（2头）不免疫作为攻毒对照组。于免疫后42d,PCV1—2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体。免疫后42d所有组攻毒PCV2和PRRSV,剂量分别为2×10^4.5 TCID50／头和10^6 TCID50／头。攻毒后21d,攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大,免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒栽量低于对照组,攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组。这些结果表明,嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后,对PCV2感染能产生保护性免疫应答,有可能成为候选疫苗。     

猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗对PCV2与猪繁殖和呼吸综合征病毒共感染猪群免疫力评价

本试验旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗对PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪生产性能及免疫保护力的影响。将287头仔猪随机分为2组,一组于出生后14 d和28 d免疫107.0TCID50PCV2疫苗各1 mL,另一组不予免疫。记录各组临床症状变化、断奶体重、保育后体重,并按时采血检测PCV2抗体。结果显示,在PCV2、PRRSV感染猪场,免疫组发病2头,死亡0头;对照组发病18头,死亡12头,免疫组发病率和死亡率明显低于对照组。二者在保育阶段增重变化差异显著(P<0.05),PCV2疫苗免疫后能够较快地产生保护力。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定

将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。     

不同接毒方法对猪圆环病毒2型增殖的影响

本试验对比了不同的接毒方法,观察猪圆环病毒2型的繁殖情况.试验分为同步接毒(A组、B组)和异步接毒(C组、D组):同步接毒A组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入5%(V/V)的PCV2种毒,B组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入3%(V/V)的PCV2种毒,24 h后再接种2%种毒;异步接毒C组为在生长良好、 培养24 h的单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒,D组为在生长良好、培养48 h的PK15单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒.四组均在接种后培养72 h收获,进行病毒含量检测.试验结果显示:A组的病毒含量为107.0~7.25TCID50/mL,B组病毒含量为106.75~7.0TCID50/mL,C组的病毒含量为106.4~6.5TCID50/mL,D组的病毒含量为106.25~6.5TCID50/mL.试验结果表明,采用同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法,在细胞悬液中同步一次性接入5%种毒,病毒的增殖量最高.     

猪圆环病毒2型SH毒株免疫原性

用D-氨基葡萄糖处理PK-15细胞,将PCV2-SH分离株增殖传代至第50代,测定病毒滴度TCID50均为10-6.25/mL.将第20代和第50代病毒液分别灭活乳化制成灭活疫苗,进行猪体免疫保护试验.结果显示,这2个不同代次的病毒制成的疫苗都能刺激机体产生较高水平的ELISA抗体,攻毒后2个免疫组的猪均没有明显的临床症状,相对日增重相似,同时病理变化和病毒血症程度明显减轻.结果表明,PCV2-SH株具有稳定的免疫原性,并可以提供有效的免疫保护作用.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）对类NADC30 PRRSV免疫保护效果的评价

类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已成为我国PRRSV的主要流行株,为了评价当前商品化疫苗对类NADC30 PRRSV的免疫保护效果,本研究将12头6周龄仔猪随机分为3组,免疫组和攻毒对照组各5头、空白对照组2头,免疫组肌注高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)105.0TCID50/头,免疫后21 d,免疫组和攻毒对照组每头各肌注2 mL和滴鼻2 mL类NADC30 PRRSV SD53-1603株(104.0TCID50/mL)。攻毒后观察各组实验猪临床症状,可见攻毒对照组所有猪均发热,持续5 d~9 d,免疫组仅2头猪发热1 d~2 d。检测各组实验猪体重变化,结果显示,攻毒后免疫组和攻毒对照组体重增长均显著低于空白对照组(p0.001),但攻毒14 d以后,免疫组体重增长显著高于攻毒对照组(p0.05)。IDEXX ELISA测定各组猪血清中PRRSV的特异性抗体,结果显示免疫后14 d可以诱导免疫组仔猪产生良好的针对PRRSV的特异性抗体。利用荧光定量PCR测定血清和组织中的病毒载量,结果显示免疫组血清和组织中的病毒载量均极显著低于对照组(p0.0001)。对PRRSV免疫后及攻毒后各组仔猪各脏器病理学观察,结果可见攻毒对照组与免疫组相比出现明显的剖检和组织病理学变化。以上结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)对类NADC30 PRRSV可以提供一定的交叉保护,该研究为评价我国现有疫苗是否对类NADC30 PRRSV具有保护效果提供了参考依据。     

猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)最小免疫剂量测定

为了确定猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(PRV JS-2012-△g I/g E株)的最小免疫剂量,本研究将25头14日龄仔猪(猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型病原抗体均为阴性)随机分成5组,每组5头。第1~4组分别接种猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV JS-2012-△g I/g E株)0.5、1、2、3 m L/头,免疫28 d后各组参照第1次免疫的剂量分别加强免疫1次,第5组实验猪不做处理作为阴性对照。免疫后,每周采集各组猪血清检测抗体水平。待第2次免疫28 d后,5组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012株第5代强毒2 m L,含病毒105.0TCID50/头。结果表明:第1次免疫后14 d,第2~4组猪PRV g B抗体全部转为阳性,而第1组猪在第1次免疫后21 d全部转阳。攻毒后,第1组有1头猪发病,表现精神沉郁、厌食和轻微神经症状,其余4头猪有一过性的发热,无任何其他异常临床表现,保护率为80%;第2~4组,实验猪只有一过性的发热,无任何其他异常临床表现,保护率为100%;第5组猪在攻毒后48 h,体温迅速上升到41℃以上,并表现为明显的精神沉郁、厌食和神经症状,发病率为100%,死亡率为40%。由此确定猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)最小免疫剂量为1 m L/头。     

猪圆环病毒2型SD/2008株对仔猪的致病性

为了明确PCV2-SD/2008株对猪的致病性,将12头5周龄健康断奶仔猪随机分为PCV2组和对照组,每组6头.PCV2组经口鼻途径接种PCV2 SD/2008株第3代细胞毒(105.61 TCID50/0.1 mL),3 mL/头,对照组经相同途径接种3 mL细胞维持液.PCV2组中的1头猪从感染后14 d开始出现间断腹泻,一直到持续到试验结束.感染后第4、5周,感染组的周平均增重显著低于对照组(P＜0.05).病理组织学检查可见PCV2感染猪的淋巴结和脾脏内淋巴细胞缺失、单核/巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润;间质性肺炎、坏死性肝炎和肾炎、小血管炎症等变化,并且感染后35 d比感染后14 d的病理变化更加严重.应用免疫组化方法在感染猪的肺、肝、脾、肾、淋巴结、小肠等多种组织中检测到了PCV2抗原,其中颌下淋巴结、肺、小肠中的阳性信号数与检出率最高.结果表明,PCV2 SD/2008株对仔猪具有明显的致病性.     

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR Ⅰ酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ 基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞.收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2 .用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证日月该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白.重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定.该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1 TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8 TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8 TCID50/0.1mL.     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性ELISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3.1/ORF2质粒;在rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒或rpcDNA3.1/ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒为下一步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗效力检验中参考疫苗的应用

制备了4批不同抗原含量的猪圆环病毒2型（PCV2）灭活疫苗,灭活前PCV2病毒含量分别为107.0、106.5、105.5和104.5TCID50/mL。对此4批PCV2灭活疫苗,利用本实验室建立的小白鼠效力检验标准进行效力检验,即以PCV2参考疫苗作为对照品,测定待检疫苗免疫小白鼠后血清中PCV2抗体效价的高低来判定疫苗效力。3次重复检测结果都显示灭活前病毒含量为107.0、106.5和105.5TCID50/mL批次的疫苗合格,而灭活前病毒含量为104.5TCID50/mL批次的疫苗不合格,这与猪体内的效力检验结果一致,表明建立的针对猪圆环病毒2型灭活疫苗的小白鼠效力检验方法具有良好的准确性和重复性。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株免疫仔猪的田间效力评估试验

本试验选择有猪圆环病毒2型感染,而且已经表现断奶仔猪消耗综合征(PMWS)临床症状的商品猪场(600头母猪)进行试验猪圆环病毒2型(SH株)灭活疫苗的相关研究,以评价猪圆环病毒2型灭活疫苗对仔猪存活率、日增重、病毒血症控制、免疫副反应等指标的变化。试验结果表明:(1)免疫后,免疫组仔猪3周龄断奶时的存活率为91.8%,高于对照组的78.57%;4周龄存活率为98.65%,也高于对照组的90.91%;(2)免疫组在疫苗免疫后1 d体温略有升高,高于对照组,但在第2天后逐步恢复正常;(3)免疫组平均增重为0.2241 kg/头·日;对照组只有0.2052 kg/头·日。免疫组要比对照组多增重0.0189kg/头·日;(4)免疫后免疫组抗体水平转阳率比对照组要高、转阳时间比对照组要早,而且第二次加强免疫后抗体转阳率更高,在49 d全部转阳;并且免疫组离散度小于对照组;(5)免疫疫苗后仔猪群病毒血症阳性率会明显下降,随后与对照组一样,逐步回升,但是,相同日龄的病毒血症阳性率明显低于对照组。上述结果表明,接种猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株有助于提高仔猪存活率,提高ADG,改善仔猪生产水平。     

关于猪伪狂犬病的免疫问题

叶培根(华中农业大学):于猪伪狂疫问题1国内PR疫苗毒株大多使用Bartha K61株,仅有华中农大的使用HB98株。2使用说明书均标明为抗原含量≥105.5TCID50/头份。多使用PBS或生理盐水为稀释剂。3免疫程序商品育肥猪:大多为1~3日龄滴鼻1头份(2毫升)/头/次,(每鼻孔1毫     

文摘

9328 伪狂犬病毒(PRV)在猪呼吸系统疾病中的潜在影响/G·J·Iglesias等//Can.J.Vet.Res. 1992,56(1):74—77为研究伪狂犬病毒(PRV)在猪呼吸系统疾病中的潜在影响,我们用PRV4892毒株经鼻腔接种二组各10头9周龄的猪,第一组感染剂量10~(4.5)TCID50/猪,第二组为10~(3.5)TCID50/猪。第一组在接种后第3     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因不同变异毒株对仔猪致病性研究

为了评价猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不同分离毒株致病性差异,选择4株PRRSV分离毒株,即YX0907、BB0907、SY0909(属于NSP2基因亚型Ⅰ,具有30aa缺失特征)和NT0801(属于NSP2基因亚型Ⅱ,其NSP2上不存在缺失)进行动物接种试验。将23头45日龄PRRSV、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌阴性健康仔猪随机分为5组,第1～4组各5头猪,分别颈部肌内注射上述4株PRRSV分离株(均为第3代)2×104.32TCID50.(mL.头)-1,第5组3头猪作为空白对照,隔离饲养21d,每天观察临床症状。攻毒后不同时间测定病毒血症,并对死亡猪和第21天处死猪进行病理剖解、观察大体病理变化和组织病理变化。结果显示,BB0907毒株毒力最强,试验猪感染后体温明显升高,临床症状明显,可引起3/5死亡,病猪肺脏组织具有明显病理变化;YX0907毒株毒力较强,试验猪临床症状和病理变化明显,可引起2/5死亡;NT0801毒力较弱,部分试验猪感染后出现1～2d体温升高和轻度临床症状,未引起死亡;SY0909毒株毒力最弱,感染猪出现1～3d体温升高,临床症状不明显,病理变化较轻;而对照猪无临床异常表现和...     

猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)的制备及免疫效力评价

本研究将猪伪狂犬病毒双基因缺失毒株(JS-2012-△g I/g E株)用0.15%的甲醛灭活后,与赛彼科公司MONTANIDE ISA201VG佐剂进行乳化,制备成猪伪狂犬病灭活疫苗。为了评价灭活疫苗的免疫效力,15头14日龄的健康仔猪(猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒Ⅱ型抗原和抗体均为阴性)随机分成3组,每组5头。第一组猪颈部肌肉接种猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)每头2 m L,接种后28 d,第一组和第二组同样方式同等剂量接种猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株),第三组猪作为对照。第二次免疫后d 28,三组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012第5代强毒,每头105.0TCID50/2 m L。攻毒后0~14 d,每日测量体温并记录临床症状。通过抗体检测和保护效率来评价猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)免疫效力。结果表明,两次免疫(第一组)PRV g B抗体水平明显高于一次免疫(第二组),两次免疫提供了更好的保护效力。     

PRRSV对仔猪免疫力的影响

为了研究PRRSV对仔猪免疫力的影响,试验将13头46日龄的健康仔猪随机分A、B、C 3组,48日龄时A组猪进行滴鼻接种PRRSV LC毒株(TCID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL/头,B组猪滴鼻接种未接毒正常细胞培养物3 mL/头;50日龄时A组、B组猪免疫猪瘟疫苗4头份,C组猪肌肉注射生理盐水4 mL;免疫后1,7,14,21,28,35天利用ELISA和MTT等方法检测试验组猪猪瘟抗体水平和外周血T淋巴细胞转化率.结果表明,A组猪瘟抗体水平和T淋巴细胞转化率显著低于B组(P<0.05)有极显著的,说明PRRSV对仔猪免疫力有一定的抑制作用.     

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒对猪的免疫效力评价

为了进一步验证含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒（rAdV—E2）在猪体上的免疫效力,将rAdV—E2按108TCID50／头接种猪2次,同时用野生型腺病毒wtAdV作为阴性对照,当抗体上升到一定程度后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,rAdV—E2免疫组（n=5）所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,并于加强免疫后3w达到峰值,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了一头猪短期体温升高外,未出现任何其它临床症状;而野生型腺病毒wtAdV免疫组（n=5）猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全部出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,剖检时可见典型猪瘟病理变化。这表明构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒rAdV—E2免疫猪后产生了很好的免疫效果,有望成为具有开发价值的活载体疫苗。