五种鸡呼吸道传染病基因芯片诊断技术的研究

用分子克隆方法获得新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒,鸡毒支原体各一段高度保守基因片段作为探针,用芯片点样仪点样到硝酸纤维膜上,制成检测基因芯片;提取样品中的RNA进行反转录,然后在PCR过程中用生物素标记,将PCR产物滴加到芯片上进行特异性杂交,对杂交结果进行扫描分析,可同时对上述5种常见禽呼吸道疾病作出诊断。此方法与PCR检测方法结果符合率在95%以上,其检出率比临床分离法要高30%以上。     

CSFV-PRRSV-JEV联合共检基因芯片的研制与初步应用

对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)联合共检基因芯片的初步应用进行了研究。选用夹缝针,BaiOR点样缓冲液,确定靶基因质量浓度为200mg/L,各样点中心间距300μm,样点直径100μm,在相对湿度为50%~60%、8~30℃条件下用晶芯?SmartArrayerTM48点样仪在氨基化基片上接触式点样,成功制备了CSFV-PRRSV-JEV检测基因芯片。将标记后的探针基因与PRRSV-CSFV-JEV基因芯片经预杂交、杂交、洗涤干燥后,用晶芯?LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪扫描观察结果。结果表明:制备的芯片特异性强,检测灵敏度可达0.295μg/L,4℃条件下可保存120d;用制备的芯片对临床67份疑似繁殖障碍性疾病的病料进行检测,与RT-PCR检测结果符合率均在94%以上,为猪繁殖障碍性疾病的检测提供了理想的检测方法。     

皮毛中5种病毒基因芯片检测方法的研究

根据GenBank上蓝舌病病毒(BTV)、O型口蹄疫病毒(FMDV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒的特异性保守序列,分别设计多重荧光标记引物和相应寡核苷酸探针.使用芯片点样液稀释各探针至终浓度30μmol/L,点样制备11×11阵列芯片.核酸杂交后,建立并优化基因芯片检测方法.结果显示,使用470 mL/L甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4h为最佳基因芯片杂交条件.建立的基因芯片检测方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)等无交叉反应,检测敏感性可达20拷贝病毒核酸.制备的基因芯片稳定,保存6个月可用.对151份临床样品进行基因芯片和商业化PCR试剂盒平行检测,两者的符合率为100％.     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了1对引物，建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明，PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析，与已报道NZ—2株的核苷酸序列同源性高达97％。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒，结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的。     

耐氟喹诺酮类病原菌gyrA基因突变的寡核苷酸芯片检测

根据大肠杆菌、沙门菌、无乳链球菌和鸡毒霉形体的gyrA基因序列，设计了通用引物和ll条寡核苷酸探针；利用点样仪将探针点在基片上，制成寡核苷酸芯片；采用PCR荧光标记靶基因，与芯片杂交，用荧光扫描仪检测信号；同时以PCR一测序法进行gyrA基因突变的检测。结果，PCR反应体系能特异性地扩增出靶基因；寡核苷酸芯片能同时检测不同病原菌GyrA第83、87位发生的突变，芯片检测结果与测序结果较为一致。结果表明，使用寡核苷酸芯片技术检测病原菌耐氟喹诺酮类基因突变是可行的；研究结果为基因芯片技术应用于兽医临床耐药性检测提供了基础。     

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为10²拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为10⁴拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。     

基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原

为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针.采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交.杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应.检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL之间.将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致.     

伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备

对伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和流行性乙型脑炎病毒（JEV）检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L,用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了PRV-PPV-JEV检测基因芯片。以CY3荧光素标记的dCTP经PCR扩增制备探针,对芯片的质量进行了评价。结果表明,制备的芯片质量好,探针最佳使用质量浓度为3 000μg/L,芯片系统检测灵敏度可达3μg/L。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV,其灵敏度高、特异性强,芯片可重复使用,室温下至少可保存4个月。     

应用基因芯片技术检测禽4种主要疫病的研究Ⅱ.检测基因芯片的构建及制备

本试验进行了NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片的构建及制备。以构建的重组质粒为模板，用PCR方法扩增制备靶基因，异丙醇沉淀法进行纯化，制备的靶基因质量浓度可达161．88～1218．36mg／L。将靶基因以点样缓冲液稀释至100mg／L，以芯片点样仪SpotArray24将靶基因点制在氨基化基片上，样点中心间距450／Lm，样点直径220／Lm。点样基片经室温干燥2h、水合处理10s、紫外线交联25min和0．2％SDS洗涤5min等系列处理后，成功制备出检测基因芯片。试验以PCR扩增标记制备检验探针，对制备的检测芯片进行质量检验。结果表明，制备的NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行检测。     

猪细小病毒检测基因芯片的构建及初步应用

本研究以猪细小病毒VP2基因为目的基因设计引物和探针,通过不对称PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,对杂交芯片进行扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪细小病毒。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物于47℃杂交1 h即可得到清晰的荧光信号,检测灵敏度可达34.5 ng/μL,同时用制备的基因芯片对临床20份疑似猪细小病毒病感染的病料进行检测,检测结果与PCR检测结果符合率达100%,表明基因芯片检侧技术是一种灵敏度高、特异好的检侧方法。该方法的建立可以快速有效地对猪细小病毒做出诊断,具有较好的应用前景。