LAMP技术快速检测食源性沙门菌hisJ基因方法的建立

为建立一种快速检测食源性沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,依据Gen Bank公布的沙门菌属hisJ基因序列,利用Primer Explorer软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法。选取鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及其他6种常见食源性细菌进行特异性试验,并对其灵敏性进行了评价。针对hisJ基因建立的LAMP方法,在63℃水浴1 h便可完成沙门菌的有效扩增,该方法的灵敏度达到102cfu/mL,高于PCR方法 100倍,特异性试验结果显示只有沙门菌LAMP扩增结果呈阳性。本研究建立的沙门菌hisJ基因LAMP检测方法具有较强的特异性及灵敏性,可用于食品中沙门菌的快速检测。     

4种肠道致病菌的多重荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌的invA基因、弗氏枸橼酸杆菌的ldh基因、奇异变形杆菌的ureR基因和迟缓爱德华菌的fimA基因的保守序列,分别设计合成4对特异性引物和4个Taqman探针,通过对PCR反应体系的优化,并对该方法的特异性、敏感性进行评估,建立了一种能同时检测沙门菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌的四重荧光定量PCR快速检测方法。该方法可特异性的检测到4种目标菌株的单一模版及混合模板,未发现不同成分间的交叉反应,最低检出限均为103cfu/mL;对22种非目标病原菌进行检测均为阴性。本研究建立的四重荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,可用于上述4种致病菌的同时快速检测。     

沙门菌多重PCR检测方法的建立及其应用

为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfl(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法.结果 显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为10...     

禽源沙门菌多重PCR检测方法的建立与应用

为了快速检测禽源沙门菌,根据已知的沙门菌全基因组序列,通过分析筛选出肠炎沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌三种血清型的特异保守序列,设计PCR引物,建立多重PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异性检测肠炎沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌,检测灵敏度分别为6.413、4.363和8.724 pg/反应。临床样品检测结果表明,多重PCR方法的检测灵敏度(54/445)高于传统细菌学检测方法(33/445)。     

鸡源致病性沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测方法,设计3对特异性引物,第1对扩增沙门菌属特异性毒力基因invA 285bp片段,第2对引物扩增沙门菌鸡宿主特异性基因fliC 600bp片段,第3对引物扩增沙门菌质粒毒力基因spvR 507bp片段,经过对反应条件的优化,建立了检测鸡源致病性沙门菌的多重PCR方法。该方法可以特异扩增携带毒力质粒的致病性鸡沙门菌,而与大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾志贺菌及普通变形杆菌均无交叉反应;对沙门菌菌液的检出下限为4.5×102 CFU/mL,对重组质粒标准品的检出下限为1.67×103拷贝/μL。应用所建立的方法对采集的223份临床疑似病料进行检测,结果检出invA基因阳性27份,占12.11%,其中invA+spvR基因阳性19份,占8.52%;invA+fliC基因阳性2份,占0.89%;invA+spvR+fliC基因阳性6份,占2.69%。表明所建立的多重PCR可用于鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测及流行病学调查。     

同时感染雏鹅的两种血清型沙门菌分离鉴定及遗传进化分析

为了解鹅源沙门菌的病原学特性,本研究从一发病雏鹅体内分离到2株细菌,根据培养特性、染色镜检、生化试验、PCR检测及血清学分型结果鉴定,分离菌分别为鼠伤寒沙门菌与印第安纳沙门菌。药敏试验表明,2个沙门菌分离株均为多重耐药菌株,其中鼠伤寒沙门菌耐3种药物(耐药率16.7%),而印第安纳沙门菌耐12种药物(耐药率66.7%);2个分离株均对头孢曲松钠、呋喃唑酮、多粘菌素B及链霉素表现高度敏感。对分离菌株16S r DNA基因进行扩增测序后,与Gen Bank登录的22株不同血清型沙门菌序列进行比较,构建系统进化树,结果显示:2个分离菌株具有较高同源性,与大多数泛嗜性血清型亲缘性较近,而与鸡沙门菌感染密切相关的血清型亲缘性相距较远。本研究为鹅沙门菌病的流行病学调查积累了数据,也为临床防控提供了试验依据。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR检测方法的建立

参考GenBank中兔巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌的fim2的基因序列,应用Premier 5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合巴氏杆菌和波氏杆菌快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对巴氏杆菌和波氏杆菌参考菌株进行PCR扩增,分别能从各自的基因组中扩增出与试验设计相符的644bp和425bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌fim2基因序列。该方法对波氏杆菌的检测下限为4×102 CFU,对巴氏杆菌的检测下限为6×101 CFU。对兔源性沙门菌、葡萄球菌、大肠杆菌、魏氏梭菌扩增结果为阴性。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鉴别诊断兔巴氏杆菌和波氏杆菌以及2者混合感染。     

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计4条特异性引物,通过对退火温度等反应条件进行优化,建立能够同时扩增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。结果表明,建立的方法最低可以检测出约含1 pg/μL的病毒样品;该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性,特异性良好。建立的方法能够对口蹄疫O型、A型、Asia-1型病毒准确定型,可广泛用于口蹄疫病毒3个血清型的快速检测和分子流行病学调查。     

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法的研究

现有猪瘟活疫苗的效力检验多采用兔体定型热反应法(RID),但该方法存在重复性差、检验周期长、数据不精确等缺点,为克服兔体定型热反应法存在的缺陷,本研究建立了一种快速、准确、稳定的检测猪瘟病毒含量及疫苗效力的间接免疫荧光方法(IFA),该方法以出现特异性荧光作为检测标准,通过添加促细胞感染剂PB增加特异性荧光数量,可以在4d内检测出猪瘟活疫苗成品或半成品病毒含量,该方法检验周期短、数据精确、重复性好,为猪瘟活疫苗效力检验方法的完善提供了有力支持。     

仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

本研究以致泻性大肠杆菌(DEC)的4种毒力因子EAST1、LT、STa和STb为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,以建立仔猪DEC的多重PCR检测方法.该方法具有较好的特异性,只对DEC产生特异性条带,对非DEC及其他病菌则呈阴性.利用所建立的多重PCR方法对吉林省各猪场采集的样本进行检测,结果表明,在测定的猪场中...     

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术.针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测.结果 显示:猪链...     

禾草内生真菌检测方法研究进展

从最初发现黑麦草(Lolium perenne)和高羊茅(Festuca arundinacea)引起家畜中毒到后来其携带的内生真菌被发现,以及进一步的研究证实,内生真菌的存在不但导致家畜中毒而且能显著提高宿主在群落中的竞争力,也因禾草内生真菌的这种重要生理和生态作用,使其逐步成为国内外研究的热点之一,这也给内生真菌检测技术的发展提供了契机。初期主要是借鉴病原真菌等微生物检测的一些较成熟的方法,对禾草内生真菌进行染色镜检或分离检测,但容易受宿主种类、物候期、检测部位等因素的影响,造成检测结果的不准确。随着分子生物学、遗传学等学科的快速发展,酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光PCR法(realtime PCR)等现代分子技术在禾草内生真菌方面的应用和改进,使得内生真菌的检测方法不断推陈出新,这些方法能在一定程度上对传统检测方法给予有效的补充。快速有效的确定禾草内生真菌的存在、分布规律、分类地位等,需要准确合理地选择特异性较强的检测方法,例如定性或定量检测,并结合经典的染色镜检和分离法对禾草内生真菌进行确定。本研究对以上内容进行了综述,以期更深层次的借鉴和发展关于其它微生物的经典检测方法,同时开发具有禾草内生真菌特异性的检测技术,这些技术不仅能够鉴定内生真菌存在与否,而且能对内生真菌进行定量和活性的检测,是发展的重要方向和热点。对内生真菌定性、定量和活性的检测是未来值得研究的重点。     

猪源大肠杆菌floR、CTX-M、mcr-1耐药基因多重PCR检测方法的建立

为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

牛种布鲁杆菌PCR检测方法的研究

为了弥补血清学和微生物学方法检测和诊断布鲁菌病的种种不足,建立用布鲁菌BCSP31聚合酶链反应（PCR）快速检测布鲁菌病原的方法。根据编码牛种布鲁菌31 000外膜蛋白基因序列设计的一对特异性引物,扩增出预期350bp的基因片段。结果,此方法具有较高的特异性和敏感性,DNA最低检测量为0.42pg。结果表明,布鲁菌病原...