H9N2亚型AIV福建分离株血凝素蛋白的特征

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)已在多个国家多种禽类中检测到,由于H9N2亚型AIV的低致病力特征,导致其在疫病防控中不被重视,目前该病在全世界范围内不断进化和流行。为明确H9N2亚型禽流感病毒(AIV)福建分离株血凝素基因编码蛋白的特征,丰富福建省H9N2亚型AIV分子流行病学信息。本研究通过选取NCBI数据库流感病毒资源库(influenza virus resource)中所有28株H9N2亚型AIV血凝素基因编码蛋白(仅选择有完整ORF毒株),其中鸡源22株和鸭源6株,通过分析其左侧结合域、右侧结合域和血凝素蛋白裂解位点的氨基酸特征,并通过和H9N2亚型AIV代表株来绘制相互之间遗传进化树。分析发现,28株H9N2亚型AIV福建株相互之间氨基酸同源性在90.5%~99.5%之间。从血凝素蛋白切割位点的氨基酸序列特征来看,所有H9N2亚型AIV血凝素裂解位点氨基酸序列均为非连续碱性氨基酸。血凝素蛋白切割位点为PARSSR↓GLF的毒株均处于H9N2亚型AIV的H9.4分支上H9 Y280分支的下部(H9.4.0分支、H9.4.1分支和H9.4.2分支),而血凝素蛋白切割位点为PSRSSR↓GLF的毒株均处于H9N2亚型AIV的H9.4分支上H9 Y280分支的上部(H9.4.3分支、H9.4.4分支、H9.4.5分支和H9.4.6分支),提示我们可根据H9N2亚型AIV血凝素裂解位点氨基酸序列特征,将我国H9N2亚型AIV分为2个大的基因亚群。对226位氨基酸位点研究发现,除5株鸭源H9N2亚型AIV早期分离株(A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997、A/duck/Fujian/MH/2003、A/duck/Fujian/FQ107/2007、A/duck/Fujian/T7/2007和A/duck/Fujian/T14/2007)此处为Q,其他所有毒株均为L。该结果说明,鸡源H9N2亚型AIV在进化的过程中也可直接获得和人源受体结合位点能力,具有直接跨种感染的潜力。通过分析研究发现,福建地区H9N2亚型AIV基因亚群复杂,应加强对该区域H9N2亚型AIV的分子流行病学调查和生物学特性研究。     

2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析

为了探究2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)HA基因的遗传进化关系,分别对2株鹌鹑源H9N2亚型AIV的HA基因进行了序列测定及遗传进化分析。结果显示,2株鹌鹑H9N2亚型AIV的HA基因核苷酸同源性为97.7%,与参考毒株A/Quail/wuxi/7/2010(H9N2)相比,分别为97.7%、97.0%,均属于h9.4.2进化分支(Y280-like亚群);其推导氨基酸裂解位点均为PSRSSR↓GL,属于低致病性AIV;均存在8个相同的潜在糖基化位点,第313位的糖基化位点正好位于HA蛋白裂解位点附近,可能影响HA的裂解,改变AIV的毒力;受体结合位点第234位均为L,具有结合哺乳动物唾液酸α-2,6受体的特征。结果表明,2株鹌鹑H9N2亚型AIV均为低致病性AIV,但具有感染人的特征,其HA基因均属于大陆H9N2亚型AIV流行谱系的h9.4.2分支。     

一株H7N9亚型禽流感病毒株HA、NA基因克隆及序列分析

对一株从家禽上分离的H7N9亚型禽流感病毒利用R T-PCR方法扩增出HA和N A基因片段,对其序列进行测定和遗传进化分析,同时对核苷酸、氨基酸同源性,受体结合位点、潜在糖基化位点、裂解位点和毒力位点进行分析。结果显示A/Chicken/SD/H7N 9株与3株人源H7N 9亚型禽流感病毒株同源性高达97.0%以上,属亚欧分支、四源重组新型H7N9亚型禽流感病毒。HA受体结合位点发生的G186V突变及宿主特异性表明SD株存在感染人的可能性但不具有感染哺乳动物的能力。HA蛋白裂解位点处两个连续的碱性氨基酸和NA蛋白颈部5个氨基酸的缺失提示该毒株属于高致病力毒株且毒力存在变强的可能性。     

3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

对近10年来在同一地区分离到的3株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增和序列分析,探讨H9N2亚型流感病毒变异情况.3个毒株的HA基因全长1 683bp,编码560个氨基酸;其裂解位点均为R-S-S-R,属于低致病力毒株;推导的HA基因氨基酸序列均含7个相同的潜在糖基化位点,受体结合位点为禽源性流感病毒特异性序列,左侧臂氨基酸均为NGQQG,右侧臂均为GTSKA.3个分离株与参考株核苷酸与氨基酸同源率均较高,仅有一些非关键位点突变.它们均属欧亚种系,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97代表株亲源关系较近.研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异.     

2012~2015年H9N2亚型AIV分离株HA基因的克隆及序列分析

为了解近年来中国部分地区H9N2亚型禽流感病毒流行特点及遗传进化情况,利用RT-PCR方法扩增2012~2015年分离的17株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因片段,并进行序列测定和遗传进化分析,同时对HA蛋白的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为87%~100%和75%~100%,均属于Y280-like亚系毒株。HA基因裂解位点均为非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA基因受体结合位点149、198、234和235位氨基酸存在变异,其中,16株分离毒株的234位氨基酸由Q突变为L,表现出人流感病毒受体结合特征。潜在糖基化位点分析结果显示,11株病毒在218位氨基酸处缺失1个糖基化位点,4株病毒在492位氨基酸处缺失1个糖基化位点,17株病毒在313位氨基酸处增加1个糖基化位点。研究结果表明,应加强对H9N2亚型AIV的流行病学监测,关注疫苗毒株与流行毒株的差异。     

二株鸭源H11N9亚型禽流感病毒的遗传进化及致病性分析

为了解从湖南省洞庭湖区鸭群中分离的2株H11N9亚型禽流感病毒变异特点、进化规律及生物学特性,本研究对2株H11N9亚型禽流感病毒的HA、NA序列进行同源性和遗传进化分析,并用2株毒株对SPF鸡进行致病性试验。结果显示,本试验分离到2株H11N9亚型禽流感毒株的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性毒株;HA基因的受体结合位点均非常保守,具有典型的禽源性特征;NA基因序列与在周边国家野鸟中分离的H11N9亚型毒株的氨基酸同源性较高;鼻腔接种SPF鸡后,均能使鸡感染并通过喉头或泄殖腔排毒,但感染的鸡均不表现明显的临床症状,并且不能使同居鸡感染排毒。     

H9N2亚型流感病毒血凝素受体结合区定点突变株拯救及其受体亲和性鉴定

利用重叠PCR技术对H9N2亚型流感病毒Y280亚系毒株A/Chicken/Jilin/DH102/2012(H9N2)的血凝素受体结合区220-loop中相对保守的226位和227位进行了氨基酸置换,并通过反向遗传技术拯救了定点突变病毒。固相酶联试验结果显示:226位为L时,病毒偏嗜结合人型受体;226位为Q时,病毒偏嗜结合禽型受体;226位为M时,病毒同时具有与2种类型受体结合的能力,但偏嗜结合人型受体;227位为Q或M时,病毒均偏嗜结合人型受体。因此,相比于227位,Q226L突变足以改变病毒的受体偏嗜性。由于近年来90%以上的H9N2病毒分离株HA226位氨基酸都是L,推测226L是H9N2病毒感染哺乳动物的重要位点。     

2株鸭源 H11N9亚型禽流感病毒的基因遗传进化及致病性分析

为了解从湖南省洞庭湖区鸭群中分离的2株 H11N9亚型禽流感病毒变异特点、进化规律及生物学特性,本研究对2株H11N9亚型禽流感病毒的HA、NA序列进行同源性和遗传进化分析,并用2株毒株对SPF鸡进行致病性试验。结果显示,本试验分离到2株 H11N9亚型禽流感毒株的 HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性毒株;HA基因的受体结合位点均非常保守,具有典型的禽源性特征;NA基因序列与在周边国家野鸟中分离的H11N9亚型毒株的氨基酸同源性较高;鼻腔接种SPF鸡后,均能使鸡感染并通过喉头或泄殖腔排毒,但感染的鸡均不表现明显的临床症状,并且不能使同居鸡感染排毒。     

我国与韩国禽流感H9N2病毒血凝素分子特性的区别

中国与韩国都发生了H9N2亚型禽流感，且都对养禽业造成了严重损失。国际上有不少学者认为韩国的H9N2亚型流感是由中国通过禽肉及其相关产品的输入而引起。本研究针对这一情况对从中国大陆分离的H9N2病毒和自GeneBank读取的韩国H9N2病毒的血凝素核苷酸序列进行了比较分析，结果表明两者属于不同的进化分支。所有中国H9N2病毒的血凝素裂解位点都为-RSSR／G-，而韩国H9N2病毒的血凝素裂解位点为-ASVR／G-、-ASYR／G-或-ASGR／G-。韩国H9N2病毒血凝素的受体结合位点的氨基酸在第183、190和226位点分别H、E和Q；而中国毒株的变异较大，在第183位点全部为N，190位点为A、T或V，第226位点为L或Q。因此，中韩两国的H9N2病毒血凝素分子特性显著不同。     

H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株复制特性研究

为了解H7N9流感病毒的生物学特性,本研究对H7N9流感病毒人源分离株(AH1)和禽源分离株(CK53)复制特性进行了系统比较研究。序列分析显示,AH1和CK53病毒在进化关系上同源性较高,仅有8个氨基酸位点差异。两株病毒分别接种禽类细胞DF1和CEF,人类细胞A549和Calu-3,检测其复制能力,结果显示在33℃和37℃两种温度条件下,两种病毒在禽类细胞中复制能力相似,但在人类细胞中AH1复制能力强于CK53。CK53在哺乳动物细胞连续培养5代后出现包含PB2/E~(627)K在内共5个氨基酸位点的突变,显示禽源分离株在哺乳动物细胞复制过程中可以迅速获得适应性突变。突变病毒CK53-P5在A549细胞中复制水平明显强于CK53,其复制能力与AH1差异不明显。本研究进一步揭示了H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株的生物学特性差异,为深入了解其致病分子机制提供了实验依据。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的遗传分析

H9N2亚型禽流感病毒自1994年在中国首次发现以来,一直在家禽中流行,其导致的产蛋下降和发病死亡给养禽业发展带来严重危害。以前的研究发现中国的H9N2亚型禽流感病毒在进化过程中形成多个基因型,其表面抗原蛋白血凝素基因(HA)可被划分为以A/chicken/Beijing/1/94、A/quail/Hong Kong/G1/97(G1)和A/chicken/Heilongjiang/35/01等为代表的3个亚群,神经氨酸酶基因(NA)可被划分为以A/chicken/Beijing/1/94、A/quail/Hong Kong/G1/97(G1)和A/chicken/Hong Kong/G9/97(G9)等为代表的3个亚群。其中类G1病毒的HA基因只在香港分离株中出现。本研究对我国2003年～2004年从禽类中分离的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进行测定和遗传演化分析,结果表明其中11株病毒的HA基因属于CK/BJ/1/94群系,NA基因属于CK/BJ/1/94或DK/HK/G9/97群系,并首次发现两株病毒含有类G1病毒HA和NA基因,而且这些类G1病毒具有不同的抗原性以及人流感病毒的受体结合位点。本研究结果提示应对H9N2病毒的防治及其公共卫生意义予以高度重视。     

10株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析

为了解中国目前H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(HA)基因的遗传变异情况,对中国不同地区分离的10株H9N2亚型AIV的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,10个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;10个分离株有7~9个潜在糖基化位点,由于基因突变有些HA基因出现了新的糖基化位点;与参考株相比,发现了4个抗原表位的突变,这些表位的突变可能引起病毒致病性的改变;受体结合位点除198位有变异外,其他位点均较保守;6株病毒234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;10个分离株HA基因与国内疫苗株的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为90.4%~99.2%和92.2%~98.7%;10个分离株同属于欧亚谱系中的A/duck/Hong Kong/Y280/97群,但差异显著,为此本试验又将其分为4个不同的亚群。人工感染排毒试验结果表明,BJ15和NJ17分离株在鸡体内具有较强的复制能力,排毒周期较长且排毒量也较大,而S145N的漂变导致在145-147位氨基酸多出1个糖基化位点NGT,可能是分离株复制能力增强的原因。     

2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

在2019年1月-2019年6月对云南出现呼吸道疫病的57个鸡场进行H9亚型禽流感检测的基础上,选取石林和楚雄2个H9亚型禽流感阳性样品进行病毒分离。从分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经反转录PCR分别扩增HA和NA基因,PCR产物纯化后进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,云南2株H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为94.2%,NA基因核苷酸序列同源性为93.6%,系统进化分析表明云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因均属于欧亚谱系中的类ADKHKY28097分支（Y280-like）,ACKYN12019和ACKYN72019 HA基因之间的同源性为94.3%,与参考毒株ACKJX2448的同源性最高,为95.6%~98.5%,与中国流行的H9N2代表株和疫苗株同源性较低。HA蛋白333-340位裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征,在29、141、298、305、313、492位氨基酸有6个糖基化位点。ACKYN12019和ACKYN72019 NA基因同源性为93.6%,与Y280-like代表毒株的同源性分别为97.1%~97.5%和93.7%~94.6%,NA蛋白缺失63、64、65位氨基酸,在44、69、86、146、200、234位氨基酸处存在6个潜在的糖基化位点,NA蛋白红细胞结合（HB）位点分析发现,368-369、399-403、432位氨基酸处存在变异。研究结果显示,H9N2亚型禽流感病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控。     

Isolation and genetic characterization of avian origin H9N2 influenza viruses from pigs in China

As pigs are susceptible to infection with both avian and human influenza A viruses, they have been proposed to be an intermediate host for the adaptation of avian influenza viruses to humans. In April 2006, a disease caused by highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) occurred in several pig farms and subsequently overwhelmed almost half of China with more than 2,000,000 cases of pig infection. Here we report a case in which four swine H9N2 influenza viruses were isolated from pigs infected by highly pathogenic PRRSVs in Guangxi province in China. All the eight gene segments of the four swine H9N2 viruses are highly homologous to A/Pigeon/Nanchang/2-0461/00 (H9N2) or A/Wild Duck/Nanchang/2-0480/00 (H9N2). Phylogenetic analyses of eight genes show that the swine H9N2 influenza viruses are of avian origin and may be the descendants of A/Duck/Hong Kong/Y280/97-like viruses. Molecular analysis of the HA gene indicates that our H9N2 isolates might have high-affinity binding to the alpha2,6-NeuAcGal receptor found in human cells. In conclusion, our finding provides further evidence about the interspecies transmission of avian influenza viruses to pigs and emphasizes the importance of reinforcing swine influenza virus (SIV) surveillance, especially after the emergence of highly pathogenic PRRSVs in pigs in China.     

Phylogenetic analysis of the hemagglutinin genes of twenty-six avian influenza viruses of subtype H9N2 isolated from chickens in China during 1996-2001

The complete coding region of hemagglutinin genes from 26 influenza A viruses of H9N2 subtype isolated from chicken flocks in China during 1996-2001 was amplified and sequenced. Sequence analysis and phylogenetic studies of H9N2 subtype viruses on the basis of data of 26 viruses in this study and 71 selected strains available in the GenBank were conducted. The results revealed that all the mainland China isolates showed high homology (94.19%-100%) and were assigned to a special sublineage in the major Eurasian lineage, in contrast to the high heterogeneity of Hong Kong SAR isolates. All the 29 mainland China isolates and six Hong Kong SAR strains also had the following common characteristics: sharing the same sequence of proteolytic cleavage site with one additional basic amino acid, RSSR, with only two exceptions; having the same amino acid motif of the receptor-binding site, YWTNV/ALY; 23 of 28 isolates bearing seven potential glycosylation sites and the remaining five having six; and sharing characteristic deduced amino acid residues Asn-183 at the receptor-binding site and Ser-130 at the potential glycosylation site. We concluded that the H9N2 subtype influenza viruses circulating in chicken flocks in China since the 1990s and Ck/HK/G9/97-like viruses isolated in Hong Kong SAR should have a common origin, whereas Qu/HK/G1/97-like viruses including human strains isolated in Hong Kong SAR might originate from other places. The available evidence also suggests that the H9N2 viruses of special lineage themselves and factors prone to secondary infections may contribute to the widespread and dominant distribution of viruses of this subtype in chicken flocks in China and other Asian countries.     

中国H9N2亚型禽流感病毒的流行现状

H9N2亚型禽流感病毒（AIVs）持续暴发和流行，不但给养禽业造成了重大损失，而且给公共卫生安全带来了潜在威胁。为了解中国H9N2 AIVs的流行现状，作者对H9N2亚型AIVs的抗原性、受体结合特性、致病性进行了总结，并且对2016—2020年的流行毒株进行了分析。结果显示，H9N2 AIVs在20多个省市地区流行，其中江西、广东、贵州、江苏等地区暴发次数较多。H9N2 AIVs主要感染鸡，少数感染水禽和小家禽，零星感染人。H9N2 AIVs主要位于h9.4.2.5分支，极少数毒株隶属h9.4.2.1分支。当前H9N2 AIVs受体的结合特性呈现双嗜性或优先结合α-2，6 SA受体。抗原相关位点处的氨基酸呈现出多态性，抗原性正在发生着改变。PB2、PA和HA蛋白获得了一些适应性突变，增强了其在哺乳动物细胞上的复制能力以及对小鼠的致病性，增加了其跨宿主传播感染哺乳动物甚者人的风险。综上所述，人们要加强对H9N2 AIVs流行情况的监测，密切关注其抗原特性及致病性的变化。     

Sequence and phylogenetic analysis of the haemagglutinin genes of H9N2 avian influenza viruses isolated from commercial chickens in Iran

To determine the genetic relationship of Iranian viruses, the haemagglutinin (HA) genes from ten isolates of H9N2 viruses isolated from commercial chickens in Iran during 1998–2002 were amplified and sequenced. Sequence analysis and phylogenetic studies were conducted by comparing each isolate with those of the available H9N2 strains at GenBank. All these ten isolates had the same sequence –R-S-S-R/G-L– of proteolytic cleavage site of the HA. Nucleotide sequence comparisons of HA gene from Iranian isolates showed 95.2–99.1% identity within the group. Five isolates had leucine (L) at position 226 instead of glutamine (Q). Phylogenetic analysis showed that all our isolates belonged to the G1-like sublineage. Also these isolates showed some degree of homology with other H9N2 isolates e.g., 94.3–96.9% with qu/HK/G1/97, 96.1–98.6% with pa/Chiba/1/97, 95.6–98.2% with pa/Narita/92A/98, and 94.0–96.3% with HK/1073/99. On the basis of phylogenetic and molecular characterization evidence, we concluded that the H9N2 subtype influenza viruses circulating in chicken flocks in Iran since 1998–2002 had a common origin. The results of this study indicated that all Iranian viruses have the potential to emerge as highly pathogenic influenza virus, and considering the homology of these isolates with human H9N2 strains, it seems that the potential of these avian influenza isolates to infect human should not be overlooked.     

禽流感病毒N4亚型神经氨酸酶基因的克隆和序列分析

应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒 A/ Turkey/ Ontario/ 6 118/ 6 8(H8N4 )毒株 ,Tri Zol L S Reagent提取病毒 RNA,RT- PCR扩增神经氨酸酶 (NA)基因全片段 ,克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了鉴定和序列测定。所获得的 NA基因片段长 14 4 1bp,编码 4 90个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列进行预测 ,有 9个潜在的糖基化位点和2 0个半胱氨酸残基     

两广地区2011--2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）的变异情况及分子流行规律,于2011-2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型A1V,并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明,分离株HA基因开放阅读框全长均为1683bp,编码560个氨基酸;HA基因核苷酸同源性为88．7％～99．6％,编码氨基酸同源性为91．8％～99．5％。本试验分离毒株与国内疫苗株（GD-SS、SH—F和SD-6）的核苷酸同源性在90．1％～92．6％之间,推导的氨基酸序列同源性在91．6％～94．8％之间。进化分析显示分离株可分为Group1和Group2两个亚分支,与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支,但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式：PARSSR＋GLF、PSRSSR＋GLF和PARLSR0GLF,均无连续碱性氨基酸的插A,符合低致病性AIv的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点;除分离株GD5和GD6外,其余分离株在HAl的216位发生Q216L氨基酸突变,表明其存在感染人的可能性。