基于16S rRNA基因序列分析家蚕肠道细菌的多样性

家蚕肠道菌群与蚕体对营养物质的消化吸收及健康性密切相关。为了解家蚕肠道细菌的多样性及雌、雄个体间肠道细菌类群的差异,通过应用454焦磷酸测序技术检测细菌16S rRNA基因序列的方法分析家蚕5龄第3天雌、雄幼虫中肠内容物中的细菌类群,共发现5 578个分类操作单元(operational taxonomic units),包括14个门、21个纲、30个目、71个科、120个属的细菌,雌、雄个体在上述分类阶元共有的肠道细菌菌群分别为8、9、20、38和46种。在属水平上对细菌菌群构成的分析显示,雄蚕肠道中的主要优势细菌为代尔夫特菌属Delftia、橙单胞菌属Aurantimonas、肠球菌属Enterococcus、嗜糖假单胞菌属Pelomonas、青枯菌属Ralstonia、台湾温单胞菌属Tepidimonas、假单胞菌属Pseudomonas、阿斯普罗单胞菌属Aspromonas、甲基杆菌属Methylobacterium和葡萄球菌属Staphylococcus;雌蚕肠道中的主要优势细菌为代尔夫特菌属Delftia、橙单胞菌属Aurantimonas、假单胞菌属Pseudomonas、嗜糖假单胞菌属Pelomonas、佩特罗菌属Petrobacter、肠球菌属Enterococcus、台湾温单胞菌属Tepidimonas、狭义的梭菌属Clostridium sensu stricto、阿斯普罗单胞菌属Aspromonas。其中,雄蚕肠道中有23个属的细菌丰度是雌蚕的1.5倍以上,在雌蚕肠道中有7个属的细菌丰度是雄蚕的1.5倍以上,表明雌性与雄性家蚕肠道细菌类群的组成和比率存在明显差异。基于16S rRNA基因序列的聚类分析显示,家蚕肠道中的优势细菌属可分为2个大类。家蚕肠道细菌的多样性研究结果可作为探讨雌蚕和雄蚕经济性状差异的新线索。     

长角血蜱肠道细菌的分离与鉴定

为深入研究肠道细菌在蜱的生理学和传播病原上的作用,本研究进行了长角血蜱肠道细菌的分离鉴定。按照细菌传统分离方法并结合16S rDNA测序鉴定,获得7个分离株,这些菌株分别属于显核菌属(Caryophanon sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)和短杆菌属(Brevibacterium sp.)5个菌属。     

桑树根际固氮细菌的分离鉴定及固氮酶活力测定

利用固氮细菌可降低桑园化肥使用量和提高桑叶产量与品质。采用选择性培养基,从桑树根际分离获得24个具有固氮能力的细菌分离株,以rep-PCR基因指纹分析聚类为18个聚类群。经固氮酶活性测定,PA19、PA2和PK1菌株具有较强的固氮酶活性。利用菌落形态特征观察及16S rDNA碱基序列测定和同源性分析,对3株细菌进行鉴定的结果是:PA19菌株为中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.),PA2菌株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),PK1菌株为土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)。     

2种嵩草属牧草休眠期内生细菌多样性研究

采用稀释平板法从两种嵩草属牧草休眠期根和种子中分离到23株内生细菌,测定了其抑菌、溶磷、固氮和产IAA等生物学功能,并通过16S rDNA 基因序列分析进行了鉴定。结果表明,两牧草根和种子中内生细菌的数量和群落组成存在明显差异;线叶嵩草内生细菌的种类比矮生嵩草丰富;矮生嵩草根部内生细菌比种子中丰富,而线叶嵩草种子内生细菌较根部丰富;种子存放时间影响内生细菌数量;20株可继代培养内生细菌中具有抑菌、溶磷、固氮和产IAA生物功能的菌株分别占总菌株数的35%,55%,45%和25%。获得15株内生细菌的16S rDNA 基因序列,经同源性比较,其分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis),且芽孢杆菌属细菌为其优势种群。     

黑广肩步甲(Calosoma maximociczi)成虫肠道细菌的分离及产脂肪酶菌株的筛选与鉴定

以柞蚕害虫黑广肩步甲(Calosoma maximociczi Morawitz)的成虫为材料,分离其肠道细菌并从中筛选产脂肪酶的菌株,了解害虫肠道细菌菌群结构,寻找具有应用价值的高产脂肪酶的微生物资源。从黑广肩步甲成虫的肠道中共分离出21个好氧细菌分离株,进一步利用选择性培养基筛选产脂肪酶的菌株并检测酶活力,获得4株产脂肪酶的优势菌株。经过生理生化特性测试和16S r DNA序列分析,确定4株产脂肪酶的菌株分别属于变形杆菌属(Proteus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。研究结果表明,黑广肩步甲成虫肠道内的细菌种类丰富,分离的4株产脂肪酶菌株的产酶活力较高,可进一步研究评价其利用价值。     

死亡马来穿山甲肠道中细菌的分离培养与鉴定

为了解马来穿山甲病变肠道菌群的组成,本研究通过对一只死亡的马来穿山甲的肠道细菌分别进行接种培养、革兰氏染色及对其16S rRNA基因序列进行PCR扩增等,对穿山甲病变肠道菌群的组成进行鉴定。高通量测序后,共获得有效序列77 441条,8个OUTs,细菌分类归属3门3纲5目6科8属。属含量从高到低分别为变形杆菌属(53.46%)、埃希氏菌属-志贺氏菌属(28.46%)、肠球菌属(17.22%)、假单胞菌属(0.7%)、普罗威登斯菌属(0.07%)、葡萄球菌属(0.05%)、拟杆菌属(0.02%)和乳杆菌属(0.02%)。结合细菌的属性及马来穿山甲病变肠道的症状分析,该马来穿山甲可能因为感染了志贺氏菌属的细菌导致严重的肠道出血而引起死亡。     

青贮饲料中纤维素降解细菌的分离与鉴定

本研究通过CMC-Na培养基分离纯化,从青贮饲料中分离得到六株纤维素降解细菌,并对其进行了形态特征观察和16S r DNA序列分析。结果表明:菌株Gs3、Gs7、Gs9、Gs10和Gs12均属于乳杆菌属(Lactobacillus),菌株Gs11-2属于醋菌属(Acetobacter)。酶活测定结果显示,菌株Gs9的相对酶活较高,为61.70 IU,是一株具有应用于青贮饲料微生物制剂开发潜力的菌株。     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物分离鉴定及多样性分析

研究为分离获得荷斯坦奶牛瘤胃内容物中的细菌,建立系统进化树,获取有益菌种。采用培养组学技术和16S rDNA分子鉴定方法相结合,对3头健康荷斯坦奶牛瘤胃内容物中细菌进行分离培养。共分离得到105株细菌,包括肠球菌属(Enterococcus)共15株14.29%,芽孢杆菌属(bacillus)共11株10.48%,不动杆菌属(Acinetobacter)共14株13.33%,葡萄球菌属(Staphylococcus)共22株20.95%,梭菌属(Clostridium)共1株0.95%,狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)共2株1.90%,短杆菌科(Brevibacteriaceae)共2株1.90%,链球菌属(Streptococcus)共11株10.48%,气球菌属(Aerococcus)共4株3.81%,柠檬酸杆菌属(Citrobacter)共14株13.33%,杆菌属(Brachybacterium)共1株0.95%,克雷伯氏菌属(Klebsiella)共1株0.95%,普罗维登斯菌属(Providencia)共3株2.86%,沙雷氏菌属(Serratia)共4株3.81%。结果中所占比例最高的菌属是葡萄球菌属;系统进化树分析和GenBank中的同源性比对结果发现,从细菌门、纲、目、科、属、种分析,分支明确;26个菌种同源性都在95.01%~100%之间。分离纯化出11株芽孢杆菌属(Bacillus)细菌具有潜在益生菌活性。可作为饲料添加剂饲喂荷斯坦奶牛。     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

普氏蹄蝠胃肠道细菌的分离与鉴定

国内外关于蝙蝠消化道细菌的研究极少,为研究普氏蹄蝠(Hipposideros pratti)胃肠道细菌的种类及数量,对普氏蹄蝠胃肠道内的细菌进行分离,采用形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列及序列同源性分析等方法,鉴定细菌的种类。结果表明,普氏蹄蝠胃肠道中存在的菌群隶属于肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、摩根菌属(Morganella)、哈夫尼菌属(Hafinia)、Gibbsibela、Lysinibacillus、乳球菌属(Lactococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Raoultella、普罗威登斯菌属(Providencia)及肠球菌属(Enterococcus)共11个属。其中革兰阴性菌占据了绝对优势,普氏蹄蝠胃内可培养的细菌数量大约为3.8×10~8 CFU/mL~7.2×10~8 CFU/mL,肠道可培养的细菌数量约8.6×10~8 CFU/mL~1.3×10~(10)CFU/mL。普氏蹄蝠胃肠道中的细菌大多为人类致病菌或条件致病菌。其结果为普氏蹄蝠胃肠道细菌的深入研究奠定了基础,并为人与蝙蝠共患疾病的预防提供基础资料。     

家蚕消化道来源蒙氏肠球菌的鉴定

研究了从家蚕消化道内分离出的4株肠球菌(C1、GC、FD、A20)的生理生化特征和16S rDNA序列,并与肠球菌种特异性探针序列进行了比较。生理生化特征测定结果表明,除A20外,C1、GC和FD与蒙氏肠球菌种的特征基本一致。由16S rDNA序列分析结果可知,分离菌株均与蒙氏肠球菌(Ent.mundtiiAJ301836)有高度同源性,在系统发育树内位于同一分支。分析肠球菌种特异性探针序列,分离菌株的16S rDNA含有与蒙氏肠球菌种特异性探针完全相同的序列。因此认为家蚕消化道内存在蒙氏肠球菌。     

不同病例动物源大肠杆菌的分离鉴定及16SrDNA同源性分析

为研究不同病例发病动物的发病原因,并对不同病例病料分离出的细菌进行16S rDNA同源性分析,本试验对10种不同病例发病动物病料进行细菌分离培养并对分离获得的细菌进行微生物学鉴定,设计1对16S rDNA基因引物,对分离出的10株细菌进行PCR扩增、测序及16S rDNA同源性分析。结果显示,分离获得的10株细菌经微生物学鉴定均为大肠杆菌,10株大肠杆菌中哺乳类动物病例犬乳房炎、犬子宫蓄脓、犬肺炎、犬皮肤化脓疮、奶牛乳房炎、犊牛腹泻6株大肠杆菌之间16S rDNA同源性为100.0%,家禽类动物病例肉鸽腹泻、肉鸡腹泻、野鸡腹泻和白孔雀腹泻4株大肠杆菌之间16S rDNA同源性也为100.0%,10株不同病例动物来源大肠杆菌之间16S rDNA同源性为97.5%~100.0%。本试验探明了10种不同病例发病动物的发病原因均为大肠杆菌感染引起,且10株大肠杆菌16S rDNA之间具有高度同源性。     

圆孢芽孢杆菌A95的分离与鉴定

从茶树根际土壤中分离获得一株对多种家蚕病原真菌具有强烈拮抗作用的细菌。经培养特征观察以及生理生化指标测定、16S rDNA碱基序列测定和同源性分析,鉴定该菌株为圆孢芽孢杆菌,定名为Bacillus globisporusA95。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank注册(登记号:AY387584)。     

1株奶牛源约翰逊不动杆菌的分离鉴定

旨在了解从奶牛垫料中分离得到1株革兰阴性菌的病原特征,本研究通过形态学观察、生化试验、染色镜检、16S rDNA同源性分析等方法对分离菌进行鉴定,并采用药敏试验测定药物敏感性,小鼠攻毒试验确定分离菌株毒力情况。结果表明,分离菌为革兰阴性菌;扩增的16S rDNA序列长度为1 283 bp,与约翰逊不动杆菌的核苷酸相似性大于99%;分离菌株对小鼠有较强的致病性,试验组小鼠死亡率达80%。分离菌对链霉素、复方新诺明等6种药物敏感,对头孢噻肟、头孢呋辛中度敏感,对青霉素、红霉素等4种药物耐药。本研究从奶牛垫料中分离到1株约翰逊不动杆菌,为奶牛源约翰逊不动杆菌的防治和研究提供了参考依据。     

四川白三叶根瘤菌遗传多样性及系统发育研究

为阐明四川部分地区野生白三叶根瘤菌的遗传多样性及系统发育地位,对分离自四川雅安、康定、泸定、西昌、成都和乐山6个地区白三叶根瘤的69株菌进行系统研究。采用16S rDNA限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和16S rDNA基因、持家基因(recA、atpD、glnII)、结瘤基因(nodC)、固氮基因(nifH)系统发育分析的方法进行了研究。结果表明,16S rDNA PCR-RFLP中所有供试菌株产生了4种酶切图谱类型,表现出较为丰富的遗传多样性。持家基因与16S rDNA基因系统发育分析结果基本一致,9株代表菌株主要分布在α-变形菌纲(Alpha-Proteobacteria)的根瘤菌属(Rhizobium),并与豌豆根瘤菌三叶草生物型(R. leguminosarum bv. trifolii) ATCC 14480^T的亲缘关系较近。PCR可扩增出nodC和nifH基因片段,但从属于土壤杆菌属(Agrobacterium)的菌株LS1105中则扩增不出这两个基因。所有供试菌株被鉴定到了种的水平,证实了68株为白三叶根瘤菌,并通过不同采样地点菌株之间的比较,发现白三叶与根瘤菌的共生关系因地理分布不同而具有多样性,对于丰富白三叶根瘤菌资源及其开发利用具有重要意义。     

贵州省某猪场体表脓肿病原菌的分离鉴定及药敏分析

为探明贵州省某猪场引起猪体表脓肿的原因,本研究对该猪场脓肿部位的脓汁进行细菌分离培养,并对分离所得的细菌进行革兰氏染色镜检、生化试验、药敏试验、16S rDNA序列分子分析及动物感染试验。结果显示,从脓汁中成功分离到了3株菌落形态不一的菌株,分别为金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌、停乳链球菌类马亚种,根据分离地点和时间将其分别命名为GZGP2018-1、GZGP2018-2和GZGP2018-3;GZGP2018-1菌株与NCBI上金黄色葡萄球菌的同源性高达99.9%,GZGP2018-2菌株与NCBI上化脓隐秘杆菌的同源性高达99.9%,GZGP2018-3菌株与NCBI上停乳链球菌类马亚种的同源性高达100%;3株分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶和氟苯尼考较敏感,对青霉素类药物和红霉素耐药;3株分离菌株对试验小鼠均具有致死性。本研究为该猪场猪体表脓肿的发病原因、实验室诊断方法及日常防控提供了理论参考。     

Phylogenetic relationship of Pasteurella pneumotropica isolates from laboratory rodents based on 16S rDNA sequence

A 1344 bp fragment of the 16S ribosomal DNA (rDNA) sequence was used to determine the genetic relationship of Pasteurella pneumotropica isolates from laboratory rodents. A total of 30 nucleotide sequences of P. pneumotropica, including 24 wild strains, 3 reference strains, and 3 nucleotide sequences deposited in GenBank, were examined for heterogeneity of their 16S rDNA sequences. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequence discriminated 5 types of branching lineages. Of these 5 types, 3 types had significant associations with mice or rats, and 2 had significant associations with the beta-hemolytic phenotype. These results suggest that 16S rDNA sequencing of P. pneumotropica isolates demonstrates genetic heterogeneity and phylogenetic discrimination in terms of their hemolytic phenotype and host associations.     

一株兔源耐药性肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

本试验旨在对从患呼吸道感染和腹泻的仔兔血液中分离的1株疑似病原菌进行鉴定。采用分离培养、镜检、生化检测、荚膜染色、16S rDNA序列测序、药敏试验和动物体内感染等方法,对该疑似菌进行了分析。结果显示,该疑似菌呈杆状、含有丰富的荚膜多糖,其16S rDNA序列与肺炎克雷伯氏菌标准菌株序列相似性达到99%,且对链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和氯霉素均表现出不同程度的显著抗性。腹腔注射该菌(10⁹ CFU/mL),仔兔全部死亡;而口腔灌喂,仔兔有较强的耐受性(无死亡)。结果表明,从患病仔兔血液中分离到1株肺炎克雷伯氏菌且具有致病性。     

一株草鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了鉴定贵州芩巩县某养殖场草鱼发病死亡的病原,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定、药敏试验、动物回归试验、16S rDNA与gyr B基因测序及系统分析进行鉴定。结果显示,本研究从发病草鱼体内分离到1株致病菌GZQG2019,分离菌在培养基中呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围呈现β-溶血环;革兰氏镜检显示,分离菌呈两端钝圆短小阴性杆菌;16S rDNA、gyr B基因序列分析显示,分离菌与维氏气单胞菌聚为一支,同源性均在99%以上;药敏试验结果显示,在使用的20种抗菌药物中,该菌对四环素、丁胺卡那、多黏菌素B和头孢曲松等10种药物敏感,对苯唑西林、青霉素、阿莫西林和庆大霉素等8种药物中度敏感,对头孢氨苄、复方新诺明2种药物耐药;动物回归试验显示,该菌对健康草鱼具有强致病性;10种毒力基因扩增结果显示,分离菌携带气溶素、热不稳定性肠毒素、溶血素、核酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和酯酶7种毒力基因。本试验成功分离到1株草鱼源维氏气单胞菌,具有较强毒力,且携带多种毒力因子;对四环素、丁胺卡那等药物敏感,对四环素、丁胺卡那等耐药,为维氏气单胞菌病临床用药提供参考依据。     

鸡源高产淀粉酶丁酸梭菌的分离鉴定

为了获得产淀粉酶的丁酸梭菌,本研究从鸡小肠表面黏液中进行丁酸梭菌的分离与筛选,首先对样品进行80℃水浴10 min除去非芽孢菌后,然后接种到TSN培养基进行菌株的分离与筛选。对分离到的菌株进行菌落形态、显微形态初步观察,然后对疑似丁酸梭菌的菌株进行产酸能力和淀粉酶酶活检测,最后对既产酸又高产淀粉酶的菌株进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析。结果表明分离到一株革兰氏阳性厌氧菌C.B1,菌体呈短杆状,能形成圆形或椭圆形芽孢,生理生化结果也符合丁酸梭菌的基本特征,16S rDNA序列长度为1450 bp,与丁酸梭菌的同源性高达99%以上,因此确定该分离菌株为丁酸梭菌,为进一步开发新的微生态制剂奠定了基础。