抗菌肽Thanatin基因与多角体蛋白Polyhedrin基因的融合表达及产物的抑菌活性分析

为利用大肠杆菌表达系统高效表达抗菌肽Thanatin并避免其抗菌活性对宿主菌的影响,将抗菌肽Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-Thanatin-polyhedrin,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE检测显示经诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35 kD)相符的目的条带。凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6 h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%。纯化融合蛋白用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白。研究结果表明家蚕核型多角体病毒多角体蛋白能够作为抗菌肽Thanatin融合标签介导其高水平表达,有助于利用基因工程技术大规模生产抗菌肽Thanatin。     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。     

家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索

为实现家兔BMP7基因原核表达及探索适宜的表达条件,采用PCR技术从pMD18-T-BMP7重组质粒中扩增获得BMP7基因成熟肽片段(mBMP7),构建原核表达工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS,并比较温度、IPTG浓度、诱导时间等因素对目的蛋白表达的影响。结果表明,mBMP7原核表达载体构建正确;工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导均可表达含有家兔BMP7成熟肽的34KDa的融合蛋白,表达产物约占菌体总蛋白的30%。在37℃、0.75 mM IPTG以及诱导150 min时,能取得较高的目的蛋白表达量;在20℃低温条件下,IPTG浓度和诱导表达时间应分别以0.20 mM和7 h为宜;另外,目的蛋白表达对工程菌生长无明显的不利影响。因此,成功地构建了家兔BMP7基因工程菌,并确定了适宜的表达条件,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达

利用PCR方法，从肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因组DNA中，分别扩增出Stx1B和Stx2B亚基的结构基因片段，然后再通过PCR将这2个片段连接起来，并定向克隆到表达质粒pET28a的Nco1和EcoR 1位点之间，构建了重组表达质粒pMB1。将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中，对重组菌株BL21(pMB1)用IPTG进行诱导表达，并对最佳诱导时间进行了探索。SDS-PAGE电泳检测结果表明。重组菌株表达出了16300的目的蛋白Stx2B-L-Stx1B；经薄层扫描分析表明，表达量约占菌体总蛋白的68．4％，且目的蛋白为包涵体表达，表达量约占细菌沉淀的84．6％。研究还表明，未用IPTG诱导的BL21(pMB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明，在3～7h的诱导时间内，目的蛋白的表达量没有明显变化。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

细胞黏附分子1（ICAM-1）ScFv基因原核载体的构建及表达

应用PCR技术扩增ICAM-1ScFv基因,经纯化测序,得到约750bp的核苷酸片段,并构建了原核重组表达质粒pET20b-ICAM-1ScFv。将重组质粒转化至表达菌BL21（DE3）中,诱导后的SDS-PAGE分析显示,pET20b-ICAM-1ScFv表达量占菌体蛋白总量的18.4%。本试验将重组蛋白的表达条件进行优化,结果表明,ICAM-1ScFv蛋白在pET20b表达载体中的最佳表达条件为37℃诱导5h。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达载体的构建及其诱导表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因(vhb)克隆到融合表达裁体pET28a，在大肠杆菌BL21(DE3)表达。重组蛋白分别在30℃和37℃诱导表达，30℃诱导获得可溶性表达。结果表明：在30℃，1．5mmol／L和2．5mmol／LIPTG诱导下，诱导4—8h透明颠菌血红蛋白可获得高表达——透明颠菌血红蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的18．7％和27．7％。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap羧基端多肽原核表达及抗原性分析

本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。     

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21.用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋向,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件.结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大.最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大.     

日本血吸虫Ⅴ型胶原蛋白α1链的原核表达分析

目前广泛应用的各类胶原及胶原蛋白多为人工提取的方法获得,为了得到高纯度原核表达的胶原蛋白,本研究构建了血吸虫V型胶原蛋白（Schistosoma japonicum type V collagen,Sj Col V）（a1）基因AY815998.1的原核表达质粒,并对其进行了原核表达。结果表明SjColV（a1）蛋白能在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中高效表达,但原核表达的融合蛋白不够稳定,且存在形式多样。本文就其表达情况进行了分析,并纯化得到原核表达的全长rSjColV（a1）,用V型胶原蛋白的单抗对其进行鉴定,同时分析其在？80℃保存的稳定性,研究结果为SjColV（a1）的深入研究和利用提供了一定的理论依据。     

甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表达及用于胶体金检测方法的研究

根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA.阳性质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫学活性,分子质量约...     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。     

荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达

应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

胸膜莫肺炎放线杆菌APXIV部分基因片段的表达及纯化

参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的AppDNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3’端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD-ApxⅣ进行BamHI、HindIII双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组表达质粒pET-ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET-ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39.5KDa。利用HiTrapFFcrude columns将表达的蛋白进行了纯化。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的原核表达及其对口蹄疫疫苗的佐剂作用

用PCR扩增鼠伤寒沙门菌基因FliC,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建了克隆质粒pMD18-FliC。克隆质粒和pET-his载体用EcoR/Nhel双酶切,将得到的纯化基因FliC亚克隆至pET-his内,构建重组质粒pET-his-FliC。酶切、测序鉴定后,分别将重组质粒转染大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,菌体蛋白超声处理,上清液用AKTA Explorer蛋白纯化系统纯化。用SDS-PAGE分析所得蛋白,发现于约53 000处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带。293-mTLR5细胞活性检测表明该融合蛋白能刺激TLR-5通路,引起NF-κB的活化。用小鼠模型检验FliC对O型口蹄疫抗原的免疫增强作用,证明其对口蹄疫疫苗具有佐剂作用。