利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。     

禽源致病性大肠杆菌分离株R质粒的研究

从本室临床分离到的２０株禽源大肠杆菌，经药敏试验筛选到四株抗性菌株提取质粒ＤＮＡ，电泳分析表明菌株各存在数量不等（１－４个）的质粒ＤＮＡ条带。分别用试剂盒回收出５种大小不同的Ｒ质粒，分别转化大肠杆菌ＤＨ５α；但只有２０．５ｋｇ、９．４ｋｂ两种质粒转化成功，并获得了相应的抗药性，用含９．４ｋｂ质粒转化的大肠杆菌攻毒，可致死小鼠，说明该质粒可能携带有毒性基因。     

猪源益生菌EP株突变株EP△asd的构建和初步应用

为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。     

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌0157z4182基因设计1对引物，并在其5'端分别加入NcoI、XhoI酶切位点，用聚合酶链反应（PCR）从本试验用的大肠杆菌O157及1株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）08、1株肠道聚集粘附大肠杆菌（EAggEC)和1株产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）菌株中也扩增出了803BP的DNA片段。以大肠杆菌0157菌株94H的DNA为模板，用上述引物做PCR，将其产物连接到载体质粒pET28a( )，然后转化到宿主菌大肠杆菌LE392，从该菌中提取重组质粒，再将其转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），用PCR，限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定，表明Z4182基因定向克隆到了载体质粒Pet28a( )。将转化子培养并经IPTG诱导后，做SDS-PAGE电泳，表明该菌株可以表达Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌O157Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。     

仔猪大肠杆菌病流行株抗性质粒的研究

对分离的２７株猪源性大肠杆菌进行抗性试验，选取１０株双抗性菌株提取质粒ＤＮＡ，电泳分析表明各菌株均存在２～４条质粒ＤＮＡ带。将２１．２２７ｋｂ和５．１４８ｋｂ质粒转化大肠杆菌ＭＣ１０６１／Ｐ３，使其获得了相应菌株的抗性，转化菌纤毛蛋白与Ｋ８８、Ｋ９９高免血清琼扩试验为阴性，证明２１．２２７ｋｂ和５．１４８ｋｂ质粒未携带Ｋ８８、Ｋ９９基因。用２１．２２７ｋｂ转化菌注射小鼠，则小鼠死亡，说明２１．２２７ｋｂ携带毒力基因。     

肝螺杆菌CdtB基因缺失株的构建与验证

试验旨在敲除肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,H.hepaticus）的CdtB基因,采用pcDNA质粒构建自杀质粒,用于敲除肝螺杆菌ATCC 51449菌株CdtB基因。根据同源重组原理,通过电击转化方法将质粒转入肝螺杆菌构建肝螺杆菌CdtB基因缺失株（ΔCdtB）。采用PCR及测序技术对ΔCdtB缺失株进行鉴定。采用生化试验、生长曲线测定检测ΔCdtB缺失株与野生型肝螺杆菌区别。结果显示,获得以质粒pcDNA构建的同源重组敲除质粒pcDNA-ΔCdtB,电击转化肝螺杆菌后经过传代筛选可获得氯霉素阳性转化子。缺失株替换片段的PCR产物为964 bp,大于野生型肝螺杆菌对应产物884 bp,测序结果表明,氯霉素抗性基因已替换了CdtB基因。比较发现,ΔCdtB缺失株与野生型菌株的尿素酶试验结果均呈阳性,并且在生长速率方面与普通血琼脂平板上无显著差异,但最终缺失株在含氯霉素的血琼脂平板上生长更多。除此之外,将获得的缺失株持续传代并进行PCR鉴定未发现回复突变,有较好的遗传稳定性。综上所述,本研究构建的基因敲除质粒pcDNA-ΔCdtB实现了对肝螺杆菌中目标基因的敲除,为肝螺杆菌基因功能研究和致病因子的发掘提供了有效的基因操作工具。     

氮磷营养盐条件下大肠杆菌对氯霉素耐药性及机理研究

为探讨氮磷营养盐对环境大肠杆菌(E.coli)耐药性的影响及其机制,本试验通过建立模型生态系统研究氮磷营养盐引发大肠杆菌对氯霉素(CHL)产生耐药表型的影响,并对分离到的耐药菌株和敏感菌株进行cat基因检测.结果显示,添加不同剂量氮磷营养盐可引发大肠杆菌对氯霉素产生耐药性,46株耐氯霉素大肠杆菌cat基因的阳性率为89.13%;16株对氯霉素敏感的大肠杆菌未检出cat基因.结果表明,模拟生态系统中加入氮磷营养盐可引发大肠杆菌对氯霉素产生耐药;氮磷营养盐引发大肠杆菌对氯霉素耐药与cat基因有关.     

猪场排污口大肠杆菌耐氯霉素基因FLO的分子流行病学调查

采用建立PCR的方法对实验室保存的135株规模化养猪场排污口的大肠杆菌进行了氯霉素耐药基因FLO的检测。结果显示135株大肠杆菌中氯霉素抗性基因FLO的检出率为36.7%,证实该耐药基因在猪场排污口普遍存在。     

大肠杆菌新型菌毛(F1987)的基因定位

对动物产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)的一种新型菌毛 (F1987)进行了相应基因的定位研究 ,通过对表达该新型菌毛 (F1987)相应 ETEC菌株的培养、质粒提取、对大肠杆菌受体菌株 DH5α的转化及阳性转化子筛选与相应菌毛表达的检定等 ,初步表明该新型菌毛 (F1987)的基因定位于质粒上     

单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建

利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。     

大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析

以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。     

降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆

根据鲑鱼降钙素基因的序列,合成了鲑降钙素基因。首先将该基因连接到以ThyA基因为选择压力的非抗性表达载体pW425t中,转化ThyA基因缺陷的大肠杆菌X51。用SacI和KpnI双酶切法和PCR法筛选出阳性重组质粒,然后采用电穿孔法将阳性重组质粒pWCT转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中。用PCR法筛选阳性重组质粒,并进行序列测定。结果表明,目的基因所编码的氨基酸序列与天然鲑降钙素的氨基酸序列完全一致。我们得到了含降钙素基因的重组乳酸杆菌。     

大肠杆菌O157:H7菌毛分子伴侣基因的克隆与表达

根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础.     

鼻疽杆菌特异性抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用“鸟枪法”分子克隆技术将鼻疽杆菌基因重组到载体质粒pBR 322的BamHⅠ酶切位点上,再转化到大肠杆菌RRⅠ中。经过耐药表型筛选,在5000个转化菌中找出了182个具有重组质粒的细菌株,其一般细菌学性质与大肠杆菌RRⅠ相同。用放射自显影法及ELISA法筛选出50号阳性表达菌株及28号弱阳性表达菌株。用免疫电镜法观测50号转化菌,可见在细菌外膜及内部都有外源基因表达。50号转化菌只与抗鼻疽菌血清反应,不与抗类鼻疽菌血清反应;它具有较弱的免疫原性,给豚鼠注射后,可使豚鼠产生抗鼻疽杆菌抗体;在其重组质粒pBM 50的外源基因插入片段上无HindⅢ、PvuⅡ及SalⅠ酶切点,只有一EcoRⅠ酶切点。质粒pBM 50的分子量约为10 kb(kilobase pair),插入的外源基因片段为5.7 kb。Eco RⅠ可把pBM 50质粒切成分子量分别为3.9及6.1 kb两部分,从而推断出质粒pBM 50的简单酶切图。     

鸡源金黄色葡萄球菌耐药基因定位的研究

从北京郊区鸡场分离到１０株耐 药性金黄色葡萄球菌,对这些菌株进行质粒消除,根据质粒消除前后的耐药性检测,发现耐各种药物的抗性基因大多数位于质粒上,少部分抗性基因位于染色体上,由质粒介导的耐药基因占７２．５％,由染色体编码的抗性基因占２７．５％,说明质粒在决定对抗生素的抵抗性中起主要作用。     

大肠杆菌磺胺类药物抗性基因的检测

为了解不同来源大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)对磺胺类药物的抗性,从鸡(128)、鸽子(86)和鹌鹑(36)的病变器官以及养殖场周围水(45)、土壤(35)中共分离到330株E.coli,应用肉汤微量稀释法和PCR方法,分离、鉴定磺胺类药物抗性菌株,检测抗生素抗性基因,分析抗生素抗性。结果显示,不同来源的330株E.coli分离株中,对磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲氧嘧啶的敏感菌株分别为118株(35.8%)、109株(33.0%)、95株(28.8%)、81株(24.5%)。磺胺类药物敏感菌株对抗生素的耐受能力依次为:氯霉素、青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、利福平;且病变器官分离菌株的抗生素抗性高于水、土壤中分离的菌株,鸡源分离菌株抗生素抗性高于鸽子、鹌鹑;菌株的磺胺类抗性基因sul1、sul2、int1检出率较高,Int2、sul3检出率较低。磺胺类抗生素抗性菌的抗性基因检出率依次为鸡、鸽子、鹌鹑、水、土壤。病变组织、水、土壤分离株中共检出182个抗性基因,其中,97株只含1种抗性基因,11株含2种抗性基因,6株含3种抗性基因,5株含有4种抗性基因,5株含有5种抗性基因。磺胺类抗生素抗性菌株有11株未检出抗生素抗性基因,而无磺胺类抗生素抗性的菌株有7株检出磺胺类抗生素抗性基因。结果表明,不同来源菌株的磺胺类药物抗性不同,E.coli的磺胺类抗生素抗性较高,且磺胺类抗生素抗性菌株具有多重抗生素抗性,E.coli磺胺类抗生素抗性的表现型与其基因型之间存在不完全吻合现象。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

一株鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药分析

对江西省樟树市某鸭养殖场送检的病死鸭进行病理剖检,通过细菌分离、生化鉴定得到1株致病性大肠杆菌。药敏试验结果表明,该菌株对头孢拉定、头孢唑啉、头孢曲松和阿莫西林等β-内酰胺类抗生素产生了严重的耐药。通过质粒提取和接合转移试验对分离菌株进行耐药性分析;提取得到一10 kb左右的质粒;质粒接合转移试验表明,成功将该质粒转化入感受态E.coli JM109,并能使E.coli JM109获得对β-内酰胺类抗生素耐药且与分离菌株的耐药谱一致。推测该菌株产β-内酰胺酶的基因存在于质粒,并且该耐药基因能随质粒的转移转化入敏感菌E.coli JM109。     

养殖场中动物源大肠杆菌blaCTX-M-27基因的传播特征探究

从2014年和2016年保存的来自河南、广东、山东和湖北4个省1 100株食品动物肠道大肠杆菌中筛选出58株blaCTX-M-27阳性菌株,采用药敏试验测定产blaCTX-M-27的大肠杆菌对20种抗生素的敏感性,并用PCR的方法检测其所携带的其他耐药基因;通过脉冲场凝胶电泳分析各菌株之间的亲缘关系,通过接合或转化试验、复制子分型和Southern blot对携带blaCTX-M-27的质粒特征进行分析。结果显示,58株blaCTX-M-27阳性大肠杆菌对除了β-内酰胺类外的其他抗生素,尤其氟喹诺酮类呈现高水平耐药;大多数菌株还同时携带2~3种编码其他抗生素的耐药基因。PFGE分型结果表明,来源于同一采样地及不同省的菌株存在克隆现象,但不同省或来自于同一省份的不同采样地之间的菌株亲缘关系较远;菌株携带的blaCTX-M-27基因全部定位在质粒上,其中38株位于可接合的IncFIB质粒,另外20株位于不可分型的质粒。     

大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及验证

根据大肠杆菌W3110菌株的waaL基因序列设计CRISPR/Cas9的作用靶点,构建sgRNA表达质粒,然后设计同源修复供体DNA序列,通过电转化法导入宿主菌内,从而构建完整的大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统。结果显示,应用该系统成功地构建了大肠杆菌waaL基因缺失株。将该系统继续用于大肠杆菌W3110菌株wecA基因的缺失,结果表明,该系统可快速高效地用于大肠杆菌基因缺失,这为构建大肠杆菌生物工程菌奠定基础。