己烯雌酚完全抗原及其单抗的制备与分析

为建立己烯雌酚免疫学检测技术,试验采用混合酸酐法制备完全抗原DES-HS-BSA,并对制备产物进行紫外光谱、红外光谱、SDS-PAGE、MS分析鉴定,以DES-HS-BSA免疫Balb/c小鼠,用ELISA试验测定抗体.结果表明:半抗原衍生物DES-HS已被成功地偶联到牛血清白蛋白上,计算得每分子牛血清白蛋白上结合26个DES-HS;ELISA试验结果证实免疫小鼠血清中含有抗己烯雌酚的抗体,将免疫好的小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单抗的杂交瘤细胞株18G5,抗体亚型为IgG3.     

己烯雌酚免疫抗原的合成与鉴定

通过重氮化法引入羧基,再用碳二亚胺法偶联BSA获得己烯雌酚(DES)免疫抗原.经紫外光谱、电泳图谱分析确证获得DES-BSA偶联物.间接酶联免疫法分析证明其免疫鼠所获得的抗体与己烯雌酚有良好的特异性.     

己烯雌酚多克隆抗体的制备和鉴定

用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫兔子,制备抗DES的特异性抗体,分别用混合酸酐法和碳二亚胺法合成的OVA-DES作为包被原检测抗体;用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亚胺法合成的OVA-DES免疫小白鼠,制备抗DES的特异性抗体,分别用混合酸酐法合成的BSA-DES和碳二亚胺法合成的BSA-DES作为包被原检测抗体。检测结果表明:三种免疫原免疫动物,都产生了DES的特异性抗体,并建立了间接阻断ELISA法。这为残留DES酶免疫检测试剂盒的制备奠定了基础。     

己烯雌酚完全抗原的合成和多克隆抗体的制备

采用混合酸酐法,将己烯雌酚与牛血清白蛋白或卵清蛋白偶联形成完全抗原.经紫外分光光度计扫描鉴定,并通过聚丙烯酰胺电泳实验,推算出牛血清白蛋白与DES-HS的结合比是1:25～1:30.以己烯雌酚-牛血清白蛋白为抗原免疫家兔,制备出多克隆抗体,经酶联免疫吸附试验和琼脂扩散试验进行鉴定,并采用酶联免疫吸附方法进行效价测定,抗血清效价均超过了1:10 000.     

ELISA间接法检测兔血清中抗牛血清白蛋白抗体

用牛血清白蛋白（BSA）免疫普通级试验兔（新西兰白兔）,获得高滴度的抗BSA血清。以系列含量的BSA溶液绘制标准曲线,测定兔血清中抗BSA抗体效价。结果表明：普通级试验兔BSA4次免疫后,兔血清中抗BSA抗体效价为1：9000。ELISA间接法敏感度高,优化了酶免疫反应条件,标准曲线线性范围内r=0．9965,可初步用于抗BSA抗体含量检测。     

雌二醇人工抗原合成及其多克隆抗体的制备

雌二醇(estradiol,EST)具有很强的生理功能,对畜禽有广泛的药理作用,但是在动物食品中残留会危害人类健康。雌二醇属于半抗原生物小分子,具有免疫反应性,但不具有免疫原性。本文中雌二醇采用混合酸酐法将肟化产物与牛血清蛋白(bovine serumalbumin,BSA)偶联,同时与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联,紫外分光光度法测定其交联率。用此合成产物进行动物体免疫,获得了雌二醇的多克隆抗体。经间接酶联免疫测定,其抗血清的稀释度可以达到1:10240,证明雌二醇免疫原的合成成功,为雌二醇酶联免疫试剂盒的研究奠定基础。     

氨基脲人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

目的合成氨基脲人工抗原并制备其多克隆抗体。方法以氨基脲(SEM)和对醛基苯甲酸(CP)为原料合成半抗原(CP-SEM),并采用碳化二亚胺法和混合酸酐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成氨基脲人工抗原。以氨基脲人工抗原(CPSEM-BSA)为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA法测定其抗体效价。结果经薄层层析、红外光谱和元素分析等方法鉴定合成半抗原即为CP-SEM。紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明人工抗原合成成功。免疫获得抗氨基脲的多克隆抗体,其抗体效价为1:64000。结论氨基脲人工抗原合成成功,并获得抗氨基脲的多克隆抗体。     

沙丁胺醇人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

为了合成沙丁胺醇(Sal)人工抗原、制备沙丁胺醇多克隆抗体,试验采用碳二亚胺法和琥珀酸酐法合成了免疫抗原Sal-HS-BSA和检测抗原Sal-HS-OVA,通过紫外扫描(UV)法和SDS-PAGE电泳法进行鉴定,并以Sal-HS-BSA免疫新西兰大白兔,获得了高效价和高敏感性的多克隆抗体。结果表明:Sal与载体蛋白上的牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵白蛋白(OVA)耦联成功,耦联比分别为7.7∶1和8.6∶1;抗体效价达到1∶1×105,对Sal的半数抑制浓度(IC50)为9.12 ng/mL。说明对人工合成抗原进行免疫可获得高效价、敏感的多克隆抗体。     

猪抗克伦特罗(CL)抗血清的制备及其IgG纯化与鉴定

为了获得高特异性、高纯度的猪抗克伦特罗 (CL)IgG ,将克伦特罗跟牛血清白蛋白 (BSA)偶联后 ,选取 1 0头大×大×约三元杂交猪 (5头为免疫组 ,5头为对照组 ) ,用偶联物BSA CL对其进行免疫 ,来制备猪抗CL抗血清。以卵清蛋白 (OVA)跟CL的偶联物OVA CL为包被抗原 ,采用ELISA法测定抗血清效价和血清阻断率。结果表明 ,有 4头猪体内产生了抗CL抗体 ,且在第 2次加强免疫后达到最大 ,效价为 1∶2 0 0 0 0 ;而当血清稀释率为 1∶40 0 ,CL的PBS液浓度在 1 8× 1 0 - 4 ～ 7 0× 1 0 - 7之间时 ,其阻断率为 80 %～ 1 8%。随后用正辛酸 硫酸铵法对血清抗体进行纯化 ,经紫外吸收法测定和SDS PAGE电泳试验结果表明IgG成份得到了纯化 ,可用于进一步的免疫试验     

盐酸克伦特罗人工抗原及抗体的制备

为了制备盐酸克伦特罗(CL)人工抗原及抗体,试验采用重氮化法将盐酸克伦特罗与经过活化的牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫抗原(CL-BSA)和检测抗原(CLOVA),经紫外光谱扫描对偶联物进行鉴定;用免疫抗原免疫BALB/c小鼠制备盐酸克伦特罗多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价。结果表明:盐酸克伦特罗人工抗原合成成功,制备的鼠源多克隆抗体效价达1∶64 000,该抗体可用于下一步试验。     

己烯雌酚半琥珀酸的合成

将己烯雌酚与丁二酸酐按一定比例溶解于无水吡啶中 ,室温下反应 3 4h。反应产物用稀盐酸溶液洗涤 ,将所得沉淀干燥后经分离纯化 ,对纯化产物进行高分辨质谱、红外光谱鉴定。结果表明 ,高分辨质谱测定出纯化物的分子量为 3 86.195 9,红外光谱鉴定出纯化物的官能团和己烯雌酚半琥珀酸相符 ,从而证明所合成的产物就是己烯雌酚半琥珀酸。本研究为己烯雌酚免疫原的合成奠定了基础     

雌二醇多克隆抗体的制备与鉴定

制备雌二醇完全抗原,并通过免疫家兔得到多克隆抗体,为下一步制备雌二醇单克隆抗体和雌二醇检测ELISA试剂盒奠定基础。试验以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用碳化二亚胺法,合成了雌二醇(E2)的2种免疫偶合物:免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联成功与否,并对偶合物的蛋白含量、结合比进行测定并以免疫原E2-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,用包被原E2-OVA进行ELISA,对多克隆抗体特异性及效价进行检测。结果表明成功合成了雌二醇人工抗原即免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA,二者的蛋白浓度分别为5.455和7.533mg/mL,结合比分别为7:1和8:1;制备的多克隆抗体特异性好,血清效价为1:106。     

氯霉素免疫原的合成与鉴定

分别采用混合酸酐法和重氮化法合成氯霉素（ＣＡＰ）免疫原。混合酸酐法：将ＣＡＰ与琥珀酸酐反应生成氯霉素琥珀酸酯（ＣＡＰ－ＨＳ）,接着进行混合酸酐反应,将ＣＡＰ－ＨＳ与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）相连,得ＣＡＰ－ＨＳ－ＢＳＡ复合物。重氮化法：将ＣＡＰ分子中的芳香硝基还原为芳香氨基,重氮化处理后,与ＢＳＡ连接。通过红外光谱和动物免疫试验鉴定合成的免疫原,结果表明ＣＡＰ－ＨＳ－ＢＳＡ合成成功。     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

建立多西环素人工抗原(Doxycycline,DOX)的合成及鉴定方法。采用戊二醛偶联法将DOX分别与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(DOX-BSA)和包被抗原(DOX-OVA)。经SDS-PAGE电泳法、紫外可见吸收光谱鉴定,证实人工抗原成功合成,偶联比分别为8.6∶1和3.8∶1。结果表明建立了一种新的DOX抗原合成方法,为进一步制备特异性DOX抗体和建立检测食品中DOX的酶联免疫方法奠定了基础。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定lBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份.应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性.结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1:105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合.本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础.     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

将多西环素（doxycycline,DOX）进行化学修饰引入羧基或氨基等活性基团,然后与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA和包被原DOX—PABA—OVA、DOX～OVA,并用紫外吸收（UV）、凝胶电泳（SDS—PAGE）和EUSA方法对人工抗原进行鉴定;将合成的人工抗原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA分别免疫BALB／C小鼠,用间接ELISA方法测定多抗（pAb）效价,用竞争ELISA方法鉴定其敏感性,用交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,二个免疫组6只小鼠血清抗体效价均在1：6400以上,DOXpAb对DOX的50％抑制浓度（IC50）在39．79～53．13μg/L,抗血清与四环素类药物交叉反应很低。本实验为建立多西环素ELISA残留免疫学检测方法和并制备多西环素试剂盒奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP3蛋白的原核表达及其B细胞抗原表位鉴定

为鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP3蛋白中的B细胞抗原表位,本研究将IBDV的VP3基因亚克隆于pET-28a中,构建了表达重组质粒pETVP3,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白(rVP3).Western blot鉴定表明,rVP3能被IBDV抗血清特异性识别.同时,根据IBDV VP3的氨基酸序列,合成覆盖VP3全序列的重叠多肽,并与载体蛋白BSA藕联制备多肽人工结合抗原.Peptide-ELISA和Dot-ELISA检测结果表明VP3中有2个线性表位可以被已制备的单克隆抗体(MAb)识别,即~(728)PRDWDRLPYLNL~(739)和~(982)PKPKPKPNAPTQ~(993);Dot-ELISA结果显示,在VP3中还存在另外4个线性多克隆抗体识别位点:~(818)SLANAPQAGSKSQRA~(831),~(851)QREKD TIUSKKMETMGIYFATP~(872),~(876)ALNGHRGPSPGQLKYWQNTREI~(897)和~(961)QMKDLLLTAMEMK~(973).这些抗原表位的鉴定为开发IBD表位疫苗奠定了基础.     

莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(Rac)与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描确定偶联成功,测得偶联物Rac-KLH浓度为3.6 mg/mL,Rac-BSA浓度为6.2 mg/mL。以偶联物Rac-KLH作为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。以Rac-BSA作为包被抗原,经间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行多次亚克隆,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9、1F3、2C11、5C3、3A10、4A8、6B7、6D5、7C11、7D3。其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价1∶500 000,对莱克多巴胺的半数阻断浓度(IC50)均为3.98 ng/mL,对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的IC50均大于2 000 ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的交叉反应率均小于0.2%。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺在0.5～100 ng/mL范围内为线性分布,确定的最低检测限为0.5 ng/mL。     

展青霉素人工抗原的制备与鉴定

为探讨展青霉素（patulin,PAT）不同抗原合成方法对完全抗原制备及抗体产生的影响,本试验利用琥珀酸酐联合活泼酯法,分别制备免疫原PAT-BSA和包被原PAT-OVA。为提高PAT与偶联蛋白的结合率,尝试将BSA修饰为EDA-BSA后与PAT进行偶联,并对比2种偶联方法制备的完全抗原免疫动物后抗血清的效价水平。同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱多种方法分析鉴定偶联结果,为PAT单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立奠定了基础。