猪瘟病毒单克隆抗体及其应用

自1985年wenvoort G C等首次应用细胞培养猪瘟病毒接种小鼠的方法建立并制备13株单克隆抗体以来,猪瘟单克隆抗体不仅越来越多的应用于猪瘟的鉴别诊断,而且还用于猪瘟病毒的分子生物学研究.论文对猪瘟病毒的单克隆抗体在猪瘟的鉴别诊断和猪瘟病毒抗原结构蛋白、保护性抗原蛋白、抗原变异以及Ez囊膜糖蛋白抗原表位分析等方面进行综述.     

单克隆抗体在猪瘟诊断上的应用

猪瘟单克隆抗体以其敏感性高、特异性强、能够识别病毒抗原结构的微小差异,同时单抗特有的理化同质性使抗原抗体反应结果便于质量控制,利于标准化和规范化等优点,在猪瘟的诊断以及强、弱毒鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就猪瘟单克隆抗体及其在猪瘟诊断中的应用进展作一综述。     

应用单克隆抗体诊断技术监控规模化猪场猪瘟流行的研究

猪瘟在我省时有暴发 ,对养猪业威胁很大 ,因此做好猪瘟监测工作对预防和控制猪瘟的流行具有重要意义。猪瘟单克隆抗体诊断新技术能识别猪瘟强毒抗体和猪瘟弱毒 (疫苗 )抗体 ,又能排除牛病毒性腹泻病毒 (ＢＶＤＶ)和绵羊边界病病毒(ＢＤＶ)所产生的非特异性抗体。因此 ,它即可用于猪瘟免疫监测又可用于猪瘟病的诊断。 1998年以来 ,我们应用该技术在猪瘟免疫监测和诊断方面做了一此推广工作 ,取得了良好的效果。现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　　猪瘟单克隆抗体试剂 ,购自北京中国兽药监察所 ,置- 2 0℃以下冰箱保存 ;猪血清样本 ,来自 …     

猪瘟病毒C株杂交瘤细胞的构建及单克隆抗体的制备与鉴定

采用猪瘟病毒C株毒（CSFV C strain）免疫BALB/C小鼠,按照常规单克隆抗体制作方法构建并筛选出能稳定分泌抗猪瘟单克隆抗体杂交瘤细胞株4株,分别命名为1C9,1B11,3C8和3G9,经鉴定,4株单克隆抗体腹水效价达到104~106。交叉试验及特异性试验表明,所制备的McAb与鸽新城疫病毒、猪蓝耳病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、鸡减蛋综合征病毒无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒（CSFV）抗原决定簇,具有高度特异性。抗CSFV McAb的成功制备,为进一步研究建立CSFV的快速诊断方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病原学及单克隆抗体制备技术研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的高度接触性、传染性、出血性以及高死亡率的传染病。20世纪中期以来,已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行,并在近几年内蔓延至欧亚两洲接壤处的格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆以及俄罗斯境内,其一旦侵入我国,将会给我国养猪业带来极大的危害。非洲猪瘟病原学研究以及制备相应的单克隆抗体对非洲猪瘟病毒快速诊断技术研究和疫苗研制有着重大的现实意义。主要从病原学和单克隆抗体制备方面对非洲猪瘟的研究进展进行了综述。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

将纯化后的猪瘟病毒免疫4只SPF级BALB/c小鼠,无菌取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经半固体培养基克隆化和间接ELISA筛选,最终获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。ELISA结果显示4株单克隆抗体效价均较高,并与其他病毒及PK-15细胞培养物无交叉反应。Western blotting结果证实3株单克隆抗体可特异性识别猪瘟病毒。间接免疫荧光试验可在细胞膜内观察到特异性绿色荧光,表明3株单克隆抗体与猪瘟病毒具有良好的反应性。该研究为猪瘟病毒新型诊断试剂开发奠定了基础。     

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

通过杂交瘤技术制备猪瘟病毒单克隆抗体，对酶联免疫吸附试验筛选的阳性单克隆抗体进行免疫组织化学研究，从中发现1株单克隆抗体能与感染猪瘟病毒的猪肾、肝病理组织切片及PK15细胞产生特异性染色反应，与非感染猪的肾、肝组织切片和PK15细胞无染色反应。单克隆抗体与猪瘟病毒感染的PK15细胞或猪肝、肾小血管内皮细胞中的猪瘟病毒呈现较强的特异性棕色着染，表明该单抗是针对猪瘟病毒的单克隆抗体，对研究猪瘟病毒在宿主细胞中的生命活动和繁殖定位有非常重要的意义。该单抗命名为YNF，培养上清液和腹水的抗体效价分别为1：80和1：10000。抗体蛋白属IgG类，亚类为IgG2／κ。     

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

应用FA及PPA-ELISA技术对猪瘟的检测

用免疫荧光抗体诊断技术及单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术对疑为猪瘟病毒感染猪进行了检测 ,重点阐述了 2种方法的技术原理和操作过程。通过用免疫荧光抗体诊断技术检测了 5份病料 ,其中有 2份为阳性 ,阳性率为 40 % ;用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术检测了猪瘟血清抗体 ,在 40头母猪血清样品中 ,猪瘟弱毒抗体效价 OD值较高 ,有 1 0 0 %的保护率 ,但是发现母猪群中有 1 0 %隐性猪瘟感染 ,其强毒抗体效价 OD值大于 0 .5,体内带有猪瘟病毒。结果及过程表明此两种诊断方法检测快速、鉴别准确、分辨率高     

猪瘟病毒单克隆抗体制备及病毒荧光检测研究

应用纯化的猪瘟病毒疫苗免疫Balb/c小鼠,以重组的E2和E0蛋白为检测抗原,筛选制备了17株抗猪瘟病毒的杂交瘤细胞株。用猪瘟病毒石门毒接种PK-15细胞,以制备的17株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验,结果显示有7株单抗呈现良好特异性荧光染色。     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。     

检测非洲猪瘟McAb-ELISA竞争试剂盒的建立及初步应用

用基因重组技术制备的非洲猪瘟蛋白P54免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,获得能稳定分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用该单克隆抗体,建立了检测血清中非洲猪瘟抗体的竞争法ELISA。实验结果表明：ELISA竞争法特异性高,无交叉反应,灵敏度高于间接免疫荧光法,可用于猪血清的非洲猪瘟抗体检测。该法的建立对非洲猪瘟实验诊断的标准以及流行病学调查具有重要的现实意义。     

间接ELISA在猪瘟抗体检测上的应用

间接ELISA以其灵敏、特异、简单、快速、稳定、高通量及易于操作等优点,在猪瘟免疫猪群抗体水平监测、猪瘟的快速诊断与流行病学调查中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就间接ELISA方法及其在猪瘟诊断上的应用概况做一综述,以期为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

Natural infections of pigs with bovine viral diarrhoea virus associated with signs resembling swine fever

Between 1976 and 1985 while using immunofluorescence in the laboratory diagnosis of swine fever (SF), 13 incidents of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infection were detected in the Netherlands. Ultimate differentiation between swine fever virus (SFV) and BVDV was based on herd evidence supported by comparative antibody studies on sera from pigs inoculated with the isolate and from contact pigs in the herd of origin, using reference strains of SFV and BVDV. Recently differentiation of SFV and BVDV has been facilitated by typing the isolates with monoclonal antibodies. Signs suspicious of SF were observed in pigs two to 16 weeks old and were always confined to animals of one litter. In most cases the affected litter died out gradually although once an animal recovered. Stillbirth and neonatal death as well as the late onset of disease and its limitation to a single litter in a herd suggested a congenital route of infection. Although transplacental infection of BVDV in pigs has been reported before, these cases are believed to be the first in which natural BVDV infections could be associated with clinical signs and pathological lesions indistinguishable from those observed in chronic SF.     

非洲猪瘟血清学诊断靶点的研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的猪高致死性传染病。ASFV编码蛋白p30、p54和p72等具有较高的免疫原性,且部分氨基酸序列较为保守,常被作为血清学诊断靶点,用于评价ASF不同阶段或发病程度的抗体水平变化,ASF血清学诊断靶点相关深入研究有助于其感染检测、致病机制和机体免疫系统反应等探究。本文系统阐述用于ASF血清学诊断的主要候选蛋白及其靶点的检测应用进展,并分析候选靶点的抗原表位（区域）及其抗体结合的特点,探讨其作为ASF血清学诊断新靶点的应用潜力。     

猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用

运用胶体金免疫层析技术,建立一种操作简单、特异性好、灵敏度高,适合临床诊断的检测猪瘟病毒的方法。本文通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金,选择15 nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体,组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测,结果显示,用试纸条检测猪瘟病毒,15min左右即可显示结果,并与荧光抗体检测方法加以比较,结果表明用此种方法可以检测猪瘟病,并且可以进行推广使用。     

重组白细胞介素-2提高PRRS抗体阳性猪的猪瘟疫苗免疫效果试验

观察了重组白细胞介素-2（IL-2）对健康成年猪和PRRS抗体阳性猪的猪瘟疫苗免疫效果的影响。结果显示,重组IL-2和猪瘟疫苗一起免疫健康猪,20d后间接血凝抗体滴度达到1∶64的猪的比例为87.5％,而不注射IL-2的对照组抗体滴度可以达到这一水平的比例只有25％。给经2次猪瘟疫苗免疫但抗体滴度在1∶32以下的PRRS抗体阳性猪单独注射IL-2,20d后,注射前检测不到抗体的猪都检测到了抗体,注射前抗体滴度在1∶8～1∶16之间的猪的抗体滴度提高到1∶32～1∶64。再次用猪瘟疫苗和IL-2共同免疫,可使抗体滴度提高4倍以上。而不注射的对照组抗体滴度则略有下降。说明重组IL-2可以减轻PRRS感染所引起的免疫抑制,提高猪瘟疫苗的免疫效果。     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

闽西地区规模化猪场猪瘟抗体水平监测及免疫效果分析

应用猪瘟正向间接血凝试验 ,检测了闽西地区规模化猪场 10 93份血清的猪瘟抗体水平。结果表明 ,猪瘟血清抗体水平≤ 1∶ 8的有 2 6 7份 ,免疫合格率为 75 .5 %。哺乳仔猪检测 10 7份 ,猪瘟血清抗体水平≤ 1∶ 8的有 34份 ,免疫合格率为 6 8%。断奶仔猪检测 333份 ,猪瘟血清抗体水平≤ 1∶ 8的有 12 3份 ,免疫合格率为 6 2 %。育肥猪检测 34 0份 ,猪瘟血清抗体水平≤ 1∶ 8的有 94份 ,免疫合格率为 72 %。母猪检测 313份 ,猪瘟血清抗体水平≤ 1∶ 8的有 16份 ,免疫合格率为 95 %。所有猪群中断奶仔猪免疫合格率最低 ,与临床上断奶仔猪猪瘟发病率最高相吻合。     

黄芪多糖注射液对猪瘟耐热保护剂活疫苗在兔体内免疫效果的影响

试验旨在研究黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)注射液作为猪瘟疫苗稀释液及黄芪多糖作为疫苗佐剂提供数据支持。用1%的黄芪多糖注射液、猪瘟疫苗专用稀释液、生理盐水3种不同猪瘟疫苗稀释液稀释兔源猪耐热保护剂活疫苗免疫兔体,比较免疫后不同时间段内血液中的淋巴细胞的活性及血清中的猪瘟抗体、白介素2(interleukin 2,IL-2)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)、新蝶呤(neopterin,Npt)水平,综合评价3种不同猪瘟疫苗稀释液对兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗在兔体内免疫效果的影响。结果表明,黄芪多糖能不同程度的提高抗体水平和多种细胞因子的含量。因此,黄芪多糖注射液可以作为猪瘟疫苗稀释液或改良现有猪瘟疫苗稀释液,黄芪多糖也可以作为猪瘟疫苗佐剂。