敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Notch1基因表达载体及转染成纤维细胞后基因表达量变化。试验以敖汉细毛羊40日龄胎儿为研究对象,提取RNA反转录并参照Gen Bank中Notch1基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Notch1基因片段,将得到的Notch1基因片段连接至pGM-T载体,构建pGM-T-Notch1克隆载体并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定后构建pcDNA3.1-Notch1重组表达载体,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞。将敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-Notch1瞬时转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术检测Notch1基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Notch1构建成功,并且转染成纤维细胞后Notch1基因的表达量升高,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。结论:成功构建了敖汉细毛羊Notch1基因的表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因表达量明显升高,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊Hoxa5基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。试验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照Gen Bank中Hoxa5基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5基因片段、将得到的Hoxa5基因连接到pGM-T载体,构建pGM-T-Hoxa5重组质粒并转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3. 1-Hoxa5重组质粒,转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3. 1-Hoxa5转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3. 1-Hoxa5构建成功,并且转染成纤维细胞后Hoxa5基因的表达量明显升高,且转染组的表达量显著地高于对照组(P 0. 05)。表明:成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊Noggin基因质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在构建敖汉细毛羊Noggin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Noggin基因mRNA及蛋白表达量的变化。实验以40日龄胎羊为研究对象,采集组织样品,通过PCR反应扩增目的基因片段,经切胶回收后连接到pEM-T1载体,构建pEM-T1-Noggin后转染到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取pEM-T1-Noggin后进行酶切鉴定。鉴定后符合标准即可构建pcDNA3.1-Noggin重组表达载体,转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养,将重组质粒pcDNA3.1-Noggin转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Noggin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-Noggin表达载体构建成功,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染组的mRNA及蛋白表达量均极显著高于对照组。本研究在细胞水平上验证了Noggin基因功能,为进一步在个体水平上研究Noggin基因功能奠定基础。     

敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体的构建及在成纤维细胞中的表达

为了构建敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体以及研究表达载体转染成纤维细胞后基因表达量的变化,试验从40日龄敖汉细毛羊肩部皮肤提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa7基因的CDS区序列设计1对引物;将PCR扩增获取的Hoxa7基因CDS片段连接到pEASYTM-T1载体上,构建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆载体,将克隆载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;从pEASYTM-T1载体上切下Hoxa7基因片段,连接到pcDNA3.1表达载体上,再次转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;将重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7瞬时转染到传代的成纤维细胞中,利用实时荧光定量PCR技术、Western-blot方法检测成纤维细胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达情况。结果表明:重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7构建成功;瞬时转染到成纤维细胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达量均极显著升高(P0.01)。说明敖汉细毛羊Hoxa7基因在成纤维细胞中能够高效表达。     

利用同源重组构建敖汉细毛羊BMPR1B真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊BMPR1B基因的表达载体及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中BMPR1B基因序列信息以及pcDNA3.1序列设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得BMPR1B基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上。鉴定pcDNA3.1-BMPR1B表达载体构建成功后,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的表达载体pcDNA3.1-BMPR1B转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测BMPR1B基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-BMPR1B表达载体构建成功,并且转染成纤维细胞后BMPR1B基因的mRNA、蛋白表达量均明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。本研究利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊BMPR1B基因表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

利用同源重组构建BMP6基因真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊BMP6基因表达载体及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。实验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,提取RNA并反转录成c DNA,参照Gen Bank中BMP6基因序列信息及pc DNA3.1载体序列设计1对含有同源臂的引物,通过PCR扩增获得BMP6基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pc DNA3.1真核表达载体上。鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功后,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pc DNA3.1-BMP6表达载体转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测BMP6基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功,并且转染成纤维细胞后BMP6基因的m RNA、蛋白表达量均明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。在本实验条件下,利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊BMP6基因表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

DKK2基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化.采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌...     

利用同源重组技术构建Chordin基因载体及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增目的基因片段,利用SoSo试剂盒将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1上。鉴定后符合标准即可将pcDNA3.1-Chordin重组表达载体转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养。经质粒提取后将重组质粒pcDNA3.1-Chordin转染至成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Chordin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:普通PCR反应产物经电泳检测后与目的基因大小一致,位于2874处,且条带单一无杂带;表达载体pcDNA3.1酶切效果良好,经电泳检测其大小位于5428 bp处,且条带单一无杂带;连接后经测序鉴定pcDNA3.1-Chordin表达载体无碱基突变,pcDNA3.1-Chordin表达载体构建成功;转染成纤维细胞后,经检测,转染组的mRNA以及蛋白表达量均极显著高于对照组。本实验成功构建了敖汉细毛羊Chordin基因的表达载体,并成功转染成纤维细胞且表达,为进一步对Chordin基因的功能研究奠定了基础。     

利用同源重组构建Chordin、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

实验旨在构建敖汉细毛羊Chordin、BMP6基因表达载体,以及将其单、共转染至成纤维细胞中,分析mRNA、蛋白表达量的变化并探究两基因间的相互作用。采集40日龄的胎羊皮肤组织样品,通过PCR反应扩增目的基因(Chordin、BMP6基因)片段,利用SoSo试剂盒将目的片段与表达载体pcDNA3.1连接。鉴定正确后,将pcDNA3.1-Chordin和pcDNA3.1-BMP6转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养。提取质粒,将构建好的质粒pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6单、共转染至成纤维细胞中。通过荧光定量PCR和Western Blot技术检测Chordin和BMP6转染后表达量的变化并探究两基因间的作用关系。结果表明:利用同源重组技术成功构建了Chordin、BMP6基因的表达载体,共转染成纤维细胞后Chordin基因的表达量明显升高且共转染组的表达量极显著高于单转染组,BMP6基因的表达量明显下降,且共转染组的表达量极显著低于单转染组。Chordin基因抑制了BMP6基因的表达,BMP6基因促进了Chordin基因的表达。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础.     

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

禽流感病毒GD／1／96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体pFastBacl质粒，PCR鉴定后，转化DH10BAC感受态细胞。提取重组秆粒rBacM,以M13为通用引物作PCR分析，证明M基因已转入其中。用Cell Fectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞，96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS－PAGE蛋白电泳和Western blot分析，证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明，重组M1蛋白可作为诊断抗原。     

表面展示猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)核定位序列部分缺失的ORF2基因(pdCap),将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的pBACsurf-1质粒中,得到重组质粒pBACsurf-1-pdCap。再将含有pdCap和gp64的融合基因克隆到杆状病毒并转移到质粒pFastBac^TM Dual中,得到重组质粒pFastBac-pdCap。然后将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组穿梭质粒Bacmid-pdCap。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-pdCap。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,该重组杆状病毒成功表达了具有良好反应原性的pdCap蛋白。     

猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建

根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因,将其克隆至pMD18-T载体,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac-to-BacR杆状病毒表达系统中转移载体pFastBacl和pFastBacHTa,进而转化人含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得两种携带P32基因的重组转染质粒:Bacmid-Bacl-P32,Bacmid-BacHT-P32,经PCR试验鉴定,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体,可分别用于转染Sf-9昆虫细胞以获得单一重组P32蛋白和六聚组氨酸融合体重组P32蛋白.     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTAORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。