家蚕核型多角体病毒几丁质酶基因

序列分析表明 :家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)编码的ChiA基因的ORF为 16 5 6个核苷酸 ,编码 5 5 1个氨基酸。同源性分析表明 :杆状病毒编码的ChiA基因在DNA水平上、氨基酸水平上都具有较好的同源性 ,与灵菌的ChiA在氨基酸水平上的同源性达 47 8%～ 5 8 5 % ,推测杆状病毒编码的ChiA基因由细菌通过基因的水平转移而来。在杆状病毒ChiA的系统树中 ,舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)为一单独分枝 ,处于进化树的最根部 ,其余可分 2组 ,其中棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)ChiA、谷实夜蛾核型多角体病毒 (HzNPV)ChiA为一组 ,其它杆状病毒的ChiA构成了第二组     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

BmNPV半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列研究

对家蚕核型多角体病毒苏州株（BmNPVsu）光胱氨酸蛋白酶基因（CP）的序列分析表明,该基因读码框为972个核苷酸,编码323个氨基酸。同源性分析表明,BmNPVsu的CP与首蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）、美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）、云杉卷叶蛾核型多角体病毒（CfNPV）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（OpNPV）、舞毒蛾核型多角体病毒（Ld-NPV）在DNA水平上的同源性分别为96.5％、76.2％、74.9％、72.7％、62.9％;在氨基酸水平上的同源性分别为96.9％、77.1％、79.3％、77.1％、65.6％。BmNPV CP的氨基酸序列与不同来源的木瓜蛋白酶超家族的CP也具有较高的同源性,特别与 Trpanosoma brucei的CP具有较高的一致性,达32％。在组织蛋白酶B、H、L、S以及木瓜蛋白酶的36个保守氨基酸残基中有31种出现在BmNPVsu的CP中,BmNPVsu CP同其它杆状病毒CP一样,可看作木瓜蛋白酶超家族成员。     

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onderstepoort疫苗株更近。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onder-stepoort疫苗株更近。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

应用RT-PCR和nested-PCR方法扩增得到含猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的目的片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。CH/S株N蛋白基因含有一个长1326bp的ORF,编码由441个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。CH/S与CV777、Chinju99、JS-2004-2和LJB/03N蛋白基因ORF的序列同源性分别为97.1%、96.8%、96.7%和96.5%;推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%、97.1%、97.1%和96.8%。以阳性质粒为模板,用分别含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增得到ORF,其PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到pET-30a载体,构建的重组质粒命名为pET-30a-PN;将pET-30a-PN转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明表达出与预期大小相符的约54.4Ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;薄层扫描结果表明表达产物占菌体总蛋白的30.5%;Western blot分析表明表达的重组蛋白能与抗PEDV高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫学活性。     

褐家鼠汉坦病毒黑龙江SC106分离株S基因特征分析

为研究家鼠型(SEO)汉坦病毒(HV)黑龙江分离株的分子特征,本研究对黑龙江省SEO型新分离株SC106的S基因进行了扩增和序列分析。结果表明:SC106株S基因全长由1775nt组成,编码的蛋白长429aa,符合SEO型编码。与HV参考毒株进行比较,SC106与SEO型同源性最高,与姬鼠型(HTN)相对较低,与其它型别同源性更低。N蛋白进化树分析表明,SC106位于SEO型病毒所在支系,与河南株R22,黑龙江株Pf26和北京株BjHD01亲缘关系接近,体现了一定的宿主依赖性和地理簇集性。序列分析表明:SC106与黑龙江省首个SEO型分离株Pf26均为SEO型中的S1亚型,它们的S基因核苷酸序列同源性也最高(99.2%),并且SC106的S基因编码的N蛋白氨基酸序列也比较保守,由此证实,HV的进化与时间关系不大。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

猪传染性胃肠炎华毒弱毒株纤突蛋白B、C抗原位点片段基因的克隆与序列分析

猪传染性胃肠炎华毒（TGEV H）是我国分离的代表毒株,H弱毒株是我国自行培育成功的具有良好免疫原性的疫苗株。应用RT－PCR方法扩增出1．3kb的目的片段,包括S基因的编码的B、C两个主要抗原位点的片段,目的片段与pUC19质粒载体进行连续,转化,鉴定后得到阳性重组质粒,命名为pTS1,将重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,其结果表明TGEV H株和S基因5’端B、C位点片段1190bp的核苷酸序列与国外的TGEV毒株Miller、Purdue-115、FS772／70及台湾省TFI毒株序列均具有很高的同源性,达94．72以上。推导的氨基酸序列同源性为94．70％以上。编码抗原位点C的序列与其它毒株完全一致,但在B位点发生改变,即第97个氨基酸发生改变,由Trp突变为Ser。该核苷酸该片段全长1261bp,包括起始密码子ATG及基因间的共同序列ACTAAAC。本研究首次报道了国内的TGEV分离株－H弱毒株S基因的RT－PCR扩增及其编码的B、C抗原位点片段的分子克隆及序列分析,为进一步揭示TGEV强弱毒差别的分子机制、开展新型疫苗及进行分子诊断的研究奠定了重要基础。     

马传染性贫血病毒强毒株gag和gp45基因的体内进化分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株体内进化规律,将3匹马分别以1×105 TCID50/匹接种EIAVLN40强毒株后,在不同时间点采取外周血,分离单核白细胞。提取白细胞中的DNA,并以其为模板,应用套式PCR技术分别扩增EIAV前病毒DNA的p15,p9和gp45基因,经克隆后进行序列分析。结果显示,与接种前EIAVLN40相比较,p15基因核苷酸和氨基酸平均差异率分别为1.8%(0～2.9%)和1.7%(0～3.6%);p9分别为2.5%(0.3%～3.8%)和2.9%(0～4.8%);gp45-Ⅰ分别为1.3%(0.3%～2.1%)和1.8%(0～3.2%),gp45-Ⅱ分别为2.1%(0～3.4%)和2.6%(0～4.7%)。在EIA发热期,每个基因核苷酸和氨基酸差异率最小;在亚临床阶段,每个基因平均差异率总体上相对较高。氨基酸变异位点分析发现,发病期(2-2、3-1)各基因氨基酸序列回复到亲本株EIAVLN40,其余时期p15基因氨基酸稳定变异位点16N/S、88T/S和112M/E;p9基因115E/G和122K/M;gp45-Ⅰ基因9T/F/L;gp45-Ⅱ基因21E/K和29G/S。此外,p15基因进化树结果显示,发热期(2-2、3-1)p15基因序列与EIAVLN40序列处于同一分支上,亚临床阶段大多数p15基因序列处于另一个大分支上;其他基因进化情况与p15基因类似。对EIAV p15、p9、gp45基因体内进化分析,有助于对EIAV在马体内感染进程的研究,为进一步研究EIAV持续感染和逃避免疫监视的机制提供参考。     

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

采用RT-PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接,进行序列测定。测序结果显示,4个毒株均含有完整的开放阅读框,并且均未发现核苷酸插入或缺失现象;分离毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.7%,氨基酸同源性为98.2%~99.3%。同源性分析表明,4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性(均在99%以上),说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大,重组的频率不是很高,同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性(均为99.4%)。交叉血凝抑制试验显示,S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位,应密切监测猪流感。     

猪圆环病毒2型江苏分离株的遗传进化分析

采用PCR方法扩增了15个猪圆环病毒2型（PCV 2）江苏分离株的基因组DNA,以这些毒株的ORF2核苷酸序列进行遗传进化分析。经序列比较发现,所有分离株均属于2b基因群,其中7株为1A/1B亚群、8株为1C亚群;毒株间核苷酸同源性为93.6%~100%,所编码的Cap蛋白氨基酸同源性为92.3%~100%。PCV 2江苏分离株Cap蛋白的主要变异区域为53~90、121~151和190~210位氨基酸;R59、R89、S90、S121、T134、S169、A190、E210为1A/1B亚群分离株的特征氨基酸,而F8、I53、N68、L89、T90、T121、N134、R169、D210、I215、K234则是1C亚群分离株的特征氨基酸。     

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ZY株TfbA基因的克隆及序列分析

对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumon iae,App)生物I型ZY(App-1)株TfbA基因进行克隆和序列测定,结果表明:ZY株TfbA基因全长1 782 bp,编码594个氨基酸残基组成的多肽;对App ZY株与AP37(App-1)株、AP213(App-5)株和AP205(App-7)株的TfbA基因进行分析比较,结果表明三型TfbA的核苷酸的同源性分别为99.8%、74.4%和72.2%;氨基酸的同源性分别为99.7%、64.1%和58.6%。系统发育进化树分析结果表明,ZY株与AP37株的亲缘关系最近。分析组成TfbA蛋白N-端重叠的16聚体多肽发现了3个有转铁蛋白结合活性的区域,长度为13或14个氨基酸。第1和第3个区域在App-1、App-5、App-7型间变异较大,同源性很低,第2个区域在App-1型和App-5型两者之间同源性高,几乎相同。     

犬冠状病毒JS1706和JS1712毒株基因组3'端分子特性分析

为了全面了解犬冠状病毒（CCoV）分离毒株JS1706和JS1712基因组3'端主要结构蛋白基因和非结构蛋白基因的分子特征,本研究设计了8组引物进行RT-PCR扩增,产物经测序和拼接后,获得了约8.7 kb基因组片段,该基因组结构及其编码蛋白顺序为5'-S-3abc-E-M-N-7ab-3'。对CCoV JS1706、JS1712株8.7 kb基因组核苷酸序列与α冠状病毒属参考毒株的相同区域核苷酸序列进行比对,结果表明,2个分离株与CCoV Ⅱ型参考毒株相似性最高（83.4%~93.1%）,其次为FCoV Ⅱ型参考毒株（87.1%~87.9%）、TGEV参考毒株（86.1%~86.8%）、CCoV Ⅰ型参考毒株（72.0%~72.1%）和FCoV Ⅰ型参考毒株（67.5%~69.9%）。JS1706、JS1712毒株与同属冠状病毒参考株的结构蛋白S、E、M和N蛋白氨基酸相似性分别为46.4%~95.2%、75.6%~100%、82.8%~99.2%和78.5%~99.7%。说明同属内冠状病毒的S基因变异度大,E、M、N基因相对保守。根据基因组3'端8.7 kb核苷酸序列和S蛋白氨基酸序列相似性比对结果,JS1706和JS1712毒株均与泛嗜型原型株CB/05相似性最高,分别为93.0%~93.1%、94.8%~95.2%,其他结构蛋白包括E、M和N氨基酸序列比对也发现与CB/05株的相似性较高,分别为97.6%~100%、92.4%~93.1%和97.9%。S蛋白氨基酸序列的进一步分析表明,JS1706和JS1712毒株的S蛋白N端有一些特有氨基酸,S蛋白氨基酸序列中没有明显的S1/S2蛋白酶切位点（RRARR）,但在958—963位氨基酸有S2'裂解位点特征基序（KRKYRS）。基于S蛋白氨基酸序列构建的系统发育进化树分析显示,CCoV JS1706和JS1712株与CCoV Ⅱa亚型参考毒株和FCoV Ⅱ型参考毒株聚集形成一个分枝。CCoV JS1706和JS1712株非结构蛋白的编码基因ORF3abc和ORF7,其结构、大小与经典疫苗株INSAVC-1相似,无明显插入、缺失和移码突变。本研究有助于深入了解国内CCoV流行毒株的分子特性,为后续分子流行病学调查、诊断试剂和疫苗研发奠定了基础。