猪圆环病毒2型感染的PCR检测

对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)典型症状的病猪,采用针对猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框2(ORF2)设计的特异性引物进行PCR检测,从病猪的组织样品中检测PCV2。从10头发病猪的组织样品中检测PCV2,结果有7头呈阳性结果。     

一例猪圆环病毒2型感染的PCR检测

对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)典型症状的病猪,采用针对猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框2(ORF2)设计的特异性引物进行PCR检测,从病猪的组织样品中检测PCV2。从10头发病猪的组织样品中检测PCV2,结果有9头呈阳性结果。     

猪圆环病毒2型感染的PCR检测及防治

对规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)典型症状的病猪，采用针对猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框2(ORF2)设计的特异性引物进行PCR检测。从20头发病猪的组织样品中检测PCV2，结果有18头呈阳性结果，检测结果在四川省首次证实了猪圆环病毒2型(PCV2)感染，并提出了相应的综合防治措施。     

2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查

为了解2018年广西猪群重要疫病流行情况,试验采集广西各地的病死猪组织样品及病猪腹泻拭子,应用多重实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,应用多重实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪圆环病毒3型（PCV3）,应用多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）。结果显示,所检测的694份组织样品中,CSFV、PRRSV、HP-PRRSV、PRV、PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为11.10%、18.88%、7.20%、5.19%、2.45%、67.00%和5.76%;2种病原混合感染率为41.21%,3种病原混合感染率为4.32%,其中PRRSV和PCV2混合感染率最高。所检测的792份肠内容物及拭子腹泻样品中,PEDV、PDCoV、TGEV、PRoV的阳性率分别为9.72%、5.81%、1.77%和6.31%;2种病原混合感染率为5.30%,其中PEDV和PRoV混合感染率最高。结果表明,当前多种重要病毒性疫病仍在广西猪群发生和流行,并且多重感染普遍存在,应进一步加强监测和防控。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型（PCV2）抗体。结果显示，所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在，161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86．95％。从上述样品中随机抽取28份样品，用PCR方法检测了PCV2ORF1基因；结果，从13份血清中扩增到了特异性PCV2ORF1基因，阳性率为46．42％。证实，西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化，采用PCR技术，对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型（PCV2）感染发病猪场的197份组织病料（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测；同时，对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流感病毒（SIV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）的检测，另外，对6个地（市）11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测。结果显示，在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份，平均阳性率为54．82％（108／197），阳性猪场62个，平均阳性率为63．92％（62／97）。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42．13％（83／197），混合感染的猪场总阳性率为57．73%（56／97）。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2，阳性率为7．10％。由此可见，PCV2感染在广西猪群中已普遍存在，混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

PCV2a与PCV2b鉴别诊断PCR方法的优化及应用

猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）是严重危害养猪业的重要病原之一,根据基因组大小可分为2个基因型：PCV2a和PCV2b。为更好地掌握PCV2a和PCV2b在我国猪场的流行情况,本研究对先前的鉴别PCR诊断方法（涉及到引物、PCR体系及程序）进行优化,并应用优化的鉴3qPCR方法对1184份PCV2阳性样品进行检测,结果显示PCV2a占30．5％（36／118）,PCV2b占37．3％（44／118）,共感染占32．2％（38／118）,与常规PCR检测结果符合率为100％,此外,对30份,瞄床送检组织和血清样品也有很高的检出率。部分鉴别PCR扩增的目的产物进行测序及序列进化树分析,表明扩增序列为PCV2a与PCV2b的特征序列。经本研究优化后的鉴别PCR方法易操作、特异性强、敏感性好,可广泛用于临床样品中PCV2a和PCV2b的快速检测。     

1例规模化猪场暴发高致病性繁殖与呼吸综合征（HPPRRS）与圆环Ⅱ型（PCV-2）混合感染的诊治

四川省邻水县的1个规模化猪场60-60日龄猪只430头相继暴发疲病,采集15头病猪血清样品和2头病死猪肺和脾脏组织病料,采用HPPRRSV RT—PCR试剂盒（军事兽医研究所涂长春教授惠赠）检测,结果是8份血清（占55．8％）和2份病料（100％）为阳性。同时,6份血清和2头病死猪肺和脾脏组织病料用PCV-2 PCR试剂盒（自制）检测,结果是3份血清（占50％）和2份病料（100％）为阳性;结果表明：该猪场暴发了HPPff,RSV和PCV2混合感染。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

免疫组化Envision法检测肺组织中猪圆环病毒抗原的研究

为了对猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的早期诊断、临床诊断和流行病学调查提供技术支持,本试验制备了兔抗PCV2多克隆抗体,采用免疫组织化学Envision二步法对30例疑似PCV2病猪肺组织的病毒抗原进行定位、半定量检测.结果表明,试验制备的兔抗PCV2抗体具有高纯度和良好的特异性;Envision法可原位检测病猪肺组织PCV2抗原的分布,其抗原的阳性表达主要出现在肺巨噬细胞胞浆内;依据阳性细胞百分率,进行染色结果判断,检出阳性病猪16例,阳性检出率为53.37%.实验证明Envision法具有高敏感、低背景、快速简便的特点,可在兽医病理诊断中推广应用.     

圆环病毒PCR技术的建立及在规模化猪场的应用

目的建立猪圆环病毒2型(PCV2)的快速PCR检测方法,并对规模化猪场进行流行病学调查。方法对疑似患有典型断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病猪进行病理学观察,针对猪圆环病毒2型开放阅读框2(ORF2)设计特异性引物进行PCR检测,建立PCR快速检测方法。对四川地区的规模化猪场进行PCV2的流行病学调查。结果建立的PCR技术可以快速检测样品中PCV2病原,可重复性好。应用此方法对9个规模化猪场的104份样品进行检测。结论 PCV2感染在规模化猪场的存在比较普遍,本研究为进一步开展疫病的检测和进行PCV2流行病学调查奠定了基础。     

猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰弱综合征的诊断

剖检北京、河北某些猪场发生的仔猪先天性震颤、断奶后发育不良、咳喘、消瘦、黄疸等症状的病猪，均显示断奶多系统衰弱综合征（PMWS）的病理学变化；电镜观察病猪的脾和淋巴结组织样品，见细胞核内堆积大量无囊膜的病毒粒子；进而从病猪的病料中分离到2株猪圆环病毒（Porcine circovirus,PVC)，经电镜观察细胞内增殖、浓度、提纯的病毒，为直径约17nm的无囊膜的病毒粒子；间接免疫荧光试验可观察到PCVⅡ特异性免疫荧光，用2对引物分别扩增分离毒株，均得到2条与PCVⅡ特异性核苷酸片段大小一致的扩增片段。     

猪圆环病毒2型在PMWS患猪体内分布的初步研究

利用建立的PCR方法对发生PMWS自然患猪的内脏组织中存在的PCV2病毒DNA进行检测,结果发现PCV2病毒主要存在于病猪的淋巴结、肾脏和脾脏中,在肝脏、肺脏中少量存在,心脏中最少。本研究对PCV2临床诊断和致病机理研究具有一定指导意义。     

猪圆环病毒2型与猪TTV混合感染的流行病学调查

根据GenBank_h发表的猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）基因组序列和TTV（Torquetenovirus）1、2型的UTR序列设计合成引物,建立了分别用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。应用建立的PCR方法对送检的广东、福建和江西等7个省份258份血液和组织样品进行了PCV2、TTV1和TTV2的检测,确定猪群中PCV2与TTV1和／或TTV2混合感染情况。结果表明,94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染,占样品总数的36．4％;193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染,占74．8％;另外,还有一些样品为三重感染,占34．5％。由此可以看出,猪群中PCV2和／或TTV1和／或TTV2的混合感染很普遍。     

四川省PPV与PCV2的病原流行病学调查

从四川省21个规模化猪场采集样品273份,利用PCR方法检测并分析了猪细小病毒和猪圆环病毒的感染及混合感染情况,结果共检出PPV病原阳性样品47份（占17．22％）;PPV阳性猪场8个（占38．1％）;种猪的感染率较高,仔猪感染率相对较低;检出PCV2病原阳性样品143份（占52．38％）,PCV2阳性猪场18个（占85．7％）;PCV2感染随猪年龄的增长而升高;检出PPV和PCV2混合感染样品29份（占10．62％）;同时存在PPV和PCV2的猪场6个（占28．7％）,混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。仅有3个猪场未检出PPV和PCV2病原,占14．3％。该结果说明PPV与PCV2及其混合感染在四川省流行广泛,对养殖业构成了较严重的危害。     

湖南省部分地区病猪和屠宰猪群猪圆环病毒感染状况调查

为了解湖南省猪圆环病毒（PCV）流行情况,采用荧光PCR方法,对来自湖南省14个市州的821份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品进行PCV1、PCV2、PCV3和PCV4荧光PCR检测。结果显示：在821份样品中,PCV阳性检出率为88.06%（723/821）,阳性检出率由高到低依次为PCV2（81.49%）、PCV3（33.98%）、PCV1（8.04%）和PCV4（1.10%）;278个样品存在两种及以上的PCV混合感染,以PCV2+PCV3混合感染最多,占82.01%;在地域分布上,PCV1、PCV2、PCV3在湖南省各地区均有分布,而PCV4分布范围较小,感染率低。结果表明,湖南省内PCV流行较为普遍,4种基因型病毒都存在,但以PCV2流行最为广泛,需要加强防控。     

猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析

近期报道在美国多个州的养猪场发现了一种新型的猪圆环病毒3型毒株(porcine circovirus 3,PCV3)。为了确定PCV3是否已经在我国南方部分省份的猪场中广泛存在,并对目前PCV2疫苗是否对PCV3感染具有交叉保护作用作出科学预测,笔者对我国南方几个省份疑似猪皮炎肾病综合征的病猪组织样品进行PCV3巢式PCR检测及其核衣壳蛋白质(capsid protein,Cap)结构的PyMol和抗原表位服务器在线模拟分析。结果首次在这些病料中检测到PCV3的存在,部分病料表现为PCV2和PCV3共感染的特性。对其Cap结构及抗原性分析发现,PCV2和PCV3表现出很大的差异。因此,推测PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性,新的疫苗研究和开发,对于将来控制PCV3流行是必要的。     

吉林部分地区TTSuVs与PCV2混合感染情况调查及其与PMWS相关性分析

为了解吉林地区猪细环病毒(TTSuVs)与II型猪圆环病毒(PCV2)混合感染情况,分析TTSuVs感染与仔猪多系统衰竭征(PMWS)的相关性。试验通过PCR技术对2019年收集到的吉林部分地区的10家规模化猪场130份血清样本进行检测;并应用本实验已建立的PCV2、TTSuVs实时荧光定量PCR检测方法,对PCV2阳性样品进行病毒载量的分析,区分PMWS病猪与PCV2亚临床感染猪,比较PMWS病猪与PCV2亚临床感染猪中TTSuVs的载量。结果显示:TTSuV1感染率为38.46%;TTSuV2感染率为57.69%;PCV2感染率为46.15%;TTSuV1与TTSuV2的混合感染率为31.54%;TTSuV1与PCV2的混合感染率为32.30%;TTSuV2与PCV2的混合感染率为44.62%;三种病毒的混合感染率为22.30%。且PMWS病猪血清中TTSuV2载量明显高于PCV2亚临床感染猪(P<0.01)。结果表明,TTSuV2载量与PMWS病的发生存在一定程度的相关性。     

安徽省屠宰生猪圆环病毒2型感染情况调查

采集安徽省4个地区（合肥、宿州、阜阳、怀宁）定点屠宰场120头屠宰生猪的脾、肺、肾、腹股沟浅淋巴结共计480份样品,应用PCR方法进行猪圆环病毒2型（PCV2）检测。结果显示,怀宁屠宰场PCV2检出率最高、达23.3％,阜阳屠宰场为10％,合肥和宿州2个屠宰场均为6．7％;PCV2阳性屠宰生猪中,脾、腹股沟浅淋巴结的PCV2检出率与肺差异显著,与肾差异极显著。结果表明,安徽省定点屠宰生猪中存在一定程度的PCV2感染,脾和淋巴结为检测PCV2的最佳组织器官。