H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列,通过Blast进行比对,在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物,引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp,应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法,对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析,以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明,所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段,参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段,没有其他条带出现,而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测,H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份,禽肺病毒阳性的样品2份;随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,经比对分析,2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源,2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154)100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点,可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

B亚型禽偏肺病毒SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的B亚型禽偏肺病毒（JN224985．1）F基因序列设计1对特异性引物,经RT—PCR扩增出214bp的目的片段。回收目的片段并与pMD18-T载体连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,筛选出阳性质粒作为模板,建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物T值在83．0～83．7℃之间,灵敏度为7．9×10^2拷贝／μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测B亚型禽偏肺病毒的sYBRGreenI荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。     

禽偏肺病毒地高辛核酸探针的制备与应用

根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒F基因的保守序列设计并合成1对引物,利用RT—PCR扩增出1条与目的片段大小一致的725bp基因片段,回收、纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的aMPV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与aMPV核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型AIV、NDV、IBV、ORT和E．coil的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对aMPV的最低检出量为5Pg。应用制备的探针对山东省不同地区的605份商品肉鸡和122份商品肉鸭进行了核酸探针检测,阳性检出率分别为36．59％和34．51％。本试验制备的aMPV地高辛探针特异性强、敏感性好,对样品的检测结果表明山东省部分地区的商品肉鸡、肉鸭中普遍存在aMPV感染。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。     

B亚型禽偏肺病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的B亚型禽偏肺病毒(JN224985.1)F基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出214bp的目的片段。回收目的片段并与pMD18-T载体连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,筛选出阳性质粒作为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物T值在83.0⁸3.7℃之间,灵敏度为7.9×102拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测B亚型禽偏肺病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究

旨在确定我国部分养鸡场的鸡出现甩头、精神萎靡和肿头综合征是否由禽偏肺病毒（aMPV）引起,本研究从山东、福建、黑龙江等地的发病蛋鸡和肉鸡场采集鼻甲骨、气管和肺等样品,首先利用aMPV特异性的RT-PCR方法对临床样品进行初步检测,将RT-PCR检测阳性样品接种Vero细胞进行病毒分离,然后利用G/F基因序列分析及间接免疫荧光试验（IFA）等鉴定病毒的亚型,最后将分离株感染SPF鸡进行致病性分析。结果显示：在采集的220份样品中,RT-PCR检测结果显示,有3份鼻甲骨样品在228 bp左右出现特异性条带,将阳性病料接种Vero细胞盲传5代后,细胞出现变圆、聚集和融合等aMPV特征性细胞病变（CPE）,表明成功分离到3株aMPV,将其分别命名为SD2001、SD2002和HLJ2101。G和F基因同源性分析显示,来自蛋鸡的SD2001、SD2002和来自肉鸡的HLJ2101分离株的G和F基因与其他B亚型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性均较高,核苷酸的相似性分别为93.4%～98.6%和95.6%～100.0%,氨基酸的相似性分别为88.7%～97.8%和97.6%～100.0%;而与A、C和D亚型的G和F基因同源性较低,核苷酸的相似性分别为27.1%～61.8%和66.8%～74.8%,氨基酸的相似性分别为16.1%～36.7%和72.5%～86.5%,这些结果表明,SD2001、SD2002和HLJ2101分离株属于B亚型aMPV。进一步利用B亚型aMPV特异性的阳性血清进行IFA检测,接种SD2001、SD2002和HLJ2101的Vero细胞均可以观察到特异性的绿色荧光信号,进一步证实3个分离株属于B亚型aMPV。选择SD2001感染3周龄SPF鸡进行了致病性研究,结果发现SPF鸡感染后3～6 d出现精神萎靡、甩头和流鼻涕等症状,鼻甲骨、气管和肺也出现病理性损伤,其发病率为90%（18/20）。3株B亚型aMPV的分离不仅有助于明确我国部分养鸡场出现肿头综合征的发病原因,同时也证实B亚型aMPV流行毒株对鸡有明显的致病性,这些结果为我国家禽疫病的诊断和有效防控提供了重要理论依据。     

1株B亚型禽偏肺病毒的分离与鉴定

从山东省多个地区的商品肉鸡养殖场采集64份疑似病料,通过RT—PCR方法检测出37份禽偏肺病毒阳性病料,以此作为病毒分离材料接种SPF鸡胚,盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞。取阳性尿囊液在CEF中培养,呈现禽偏肺病毒典型细胞病变（CPE）：细胞变圆、悬浮,有合胞体形成。将分离株接种于Veto细胞及DF-1细胞均出现类似病变。对分离株F基因进行测序,并与GenBank中发表的部分代表序列比较。结果显示,与B亚型禽偏肺病毒的核苷酸同源性最高,为97．4％～99．3％;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77．4％～78．1％;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69．5％～69．7％。基因分型显示分离株为B亚型禽偏肺病毒,将该毒株命名为禽偏肺病毒SDWF株。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测方法建立与初步应用

为建立一种能够快速检测新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的方法,本研究参考GenBank上登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物.经条件优化后,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.对其特异性、敏感性和重复性进行检验.结果显示：该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符,长度为298 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到83.4 pg病毒RNA;而其它病毒：番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒等样品的扩增结果均为阴性.采用该方法对在广东不同地区采集的15份鸭病料样品进行检测,NDRV阳性率为53.33％.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查.     

1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

猪环曲病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中猪环曲病毒N基因设计合成2对特异性扩增引物,成功建立了猪环曲病毒的套式RT-PCR快速检测方法。为验证本方法的特异性,以猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪嵴病毒、沙门菌及大肠杆菌作为阴性对照,结果显示只有在猪环曲病毒的核酸作为模板时才能扩增出预期的258bp和198bp 2条片段。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为1pg。结果表明,建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于猪环曲病毒的临床检测和流行病学调查。利用本方法对采集自四川省部分地区的50份临床样品进行检测,猪环曲病毒阳性率为30%。