白头翁汤中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素和秦皮苷同时检测高效液相色谱法的建立及各药味对其溶出的影响

为了考察白头翁汤中其他药味对秦皮主要有效成分溶出的影响,试验采用高效液相色谱法(HPLC)[Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱,以乙腈(A溶液)-0.1%磷酸(含0.2%三乙胺,B溶液)为流动相进行梯度洗脱,0~23 min,流动相中A溶液含量由10%逐渐升为20%,流速0.8 m L/min,检测波长345 nm,柱温30℃,进样量10μL]检测白头翁汤及相关组方中的秦皮素、秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素。结果表明:秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素浓度分别在0.090~22.500,0.120~29.800,0.110~27.100,0.076~19.000μg/m L内,线性关系良好;仪器精密度、方法的重复性、稳定性、加样回收试验的相对标准偏差(RSD)均在2.0%以内;秦皮素溶出率受其他物质影响不大;黄柏和白头翁汤醇提液能明显增大秦皮乙素的溶出;白头翁汤中秦皮苷溶出率都低于秦皮药材;秦皮甲素的溶出规律与秦皮苷非常相似。说明该方法准确灵敏,可用于白头翁汤等相关中药组方中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的含量测定;白头翁汤中的黄连、黄柏、白头翁对秦皮中秦皮素、秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素的溶出都有影响。     

武威市人工种植紫花地丁与野生紫花地丁中总黄酮、总多糖及秦皮乙素的含量比较

通过测定武威市人工种植紫花地丁与野生紫花地丁中总黄酮、总多糖及香豆素类成分秦皮乙素,评价人工种植紫花地丁的品质,为人工种植提供参考。分别取武威人工种植的在不同季节采收的4批紫花地丁及野生紫花地丁,通过紫外分光光度法及HPLC法测定紫花地丁中总黄酮、总多糖及秦皮乙素含量。结果显示,4批人工种植紫花地丁及野生紫花地丁样品总黄酮分别为22.33 mg/g、20.25 mg/g、15.25 mg/g、18.95 mg/g、24.48 mg/g;总多糖含量分别为5.15 mg/g、4.77 mg/g、2.85 mg/g、4.94 mg/g、5.53 mg/g;秦皮乙素含量分别为224.58μg/g、208.52μg/g、98.78μg/g、185.42μg/g、214.33μg/g。与野生紫花地丁相比,春秋两季采收的人工种植紫花地丁中总黄酮、总多糖及秦皮乙素的含量均无显著性差异(P0.05);而夏季采收的紫花地丁总黄酮、总多糖及秦皮乙素含量差异显著性(P0.05),说明春秋二季采收的紫花地丁可以替代野生紫花地丁。     

HPLC法测定痢宝中秦皮甲素和秦皮乙素的含量

痢宝是中国农业科学院兰州畜牧与曾药研究所研发的一种用于治疗犊牛腹泻的口服中药制剂，在兽医临床上已取得了较好的治疗效果。该药由秦皮、马齿苋、白头翁、甘草等药材经合理的煎煮工艺制成，秦皮为该药的主要组成成分，主要含秦皮甲素和秦皮乙素为了建立该药质量控制的方法，笔者等采用反相HPLC法测定了制剂中秦皮甲素和秦皮乙素的含量．     

苦参碱对PRRSV的体外抑制作用及其机制

本试验以Marc-145细胞为模型,采用细胞病变(CPE)抑制试验和MTT法测定细胞活力,观察苦参碱(matrine)体外抗猪繁殖呼吸与综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)活性,并从抑制病毒复制、阻断吸附和直接杀灭3个方面探讨苦参碱体外抑制PRRSV的作用机制.结果显示,苦参碱CC50＞1 500 mg/L,最大安全浓度为750 mg/L,EC50为(443.5±33.4)mg/L,SI≥3.38,在安全浓度范围内对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制率达到93.6％;在直接杀灭和复制抑制试验中最高抑制率分别达到105.10％和91.53％;在病毒吸附抑制试验中抑制率＜20％,表明苦参碱不能阻断PRRSV对Marc-145细胞的吸附.结果表明,苦参碱在体外可有效抑制PRRSV对Marc-145细胞的感染,其抗病毒机制可能是干扰病毒的复制或/和直接杀灭病毒,提示苦参碱可作为研发预防及治疗猪蓝耳病的药物或先导化合物.     

白头翁汤中6种指标成分含量测定

建立高效液相色谱法(HPLC)测定白头翁汤中4味中药(白头翁、黄连、黄柏及秦皮)的6种成分含量的方法。采用安捷伦色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),以乙腈-1mg/mL磷酸水溶液为流动相进行线性梯度洗脱,检测波长205nm,流速0.8mL/min(白头翁皂苷B4)、检测波长335nm,流速1.0mL/min(盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、秦皮甲素和秦皮乙素)。秦皮甲素在1.04μg^6.24μg(r=0.9999)、秦皮乙素在0.92μg^5.52μg(r=0.9998)、盐酸药根碱在0.7μg^4.2μg(r=0.9987)、盐酸巴马汀在1.04μg^6.24μg(r=0.9978)、盐酸小檗碱在2.2μg^13.2μg(r=0.9979)、白头翁皂苷B4在5.5μg^33μg(r=0.9980)范围内线性关系良好。秦皮甲素、秦皮乙素、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4的加样回收率分别98.74%、98.12%、97.90%、96.95%、97.43%和98.45%,RSD均在2.0%以下,秦皮甲素、秦皮乙素、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗碱和白头翁皂苷B4在白头翁汤供试品中的含量分别为0.7%、0.36%、0.12%、0.38%、8.26%和4.71%。所建立的方法重复性、线性及稳定性等良好,准确灵敏,可用于白头翁汤及相关制剂的质量控制。     

黄芩苷体外抗传染性法氏囊病病毒作用

为探讨黄芩苷体外抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染鸡胚成纤维细胞系(DF1)作用机制,以DF1细胞为宿主细胞,利巴韦林为阳性对照药物,从黄芩苷对IBDV的直接灭活作用、阻滞作用、抑制吸附、穿入及其复制5个方面探讨黄芩苷抗IBDV机理。结果显示,黄芩苷的CC50为(206.48±12.74)mg/L,EC50为(46.76±3.15)mg/L,选择指数SI为4.415,在无毒质量浓度范围内其对IBDV的最高抑制率为72.02%;在阻滞试验和复制抑制试验中最高抑制率分别达到60.85%和68.11%;在病毒吸附、穿入抑制和直接灭活试验中抑制率很低,表明黄芩苷不能阻断IBDV对DF1细胞的吸附、穿入和直接灭活。结果表明,黄芩苷在体外可有效抑制IBDV对DF1细胞的感染,其抗病毒机制可能是干扰病毒的复制和阻滞,提示黄芩苷可作为预防及治疗传染性法氏囊病病毒的药物。     

复方术芩提取液体外抗PEDV感染PK-15细胞的作用效果

为探讨复方术芩提取液体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞作用效果,以Vero细胞为宿主细胞,通过检测药物抗PEDV活性,计算其IC50和治疗指数TI,并从药物对PEDV的直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制、穿入抑制及复制抑制5个方面探讨复方术芩抗PEDV作用机理。结果显示复方术芩提取液能明显抑制PEDV的致病变作用,其IC50为17.41mg/L,TI为23.40。各浓度术芩提取液对PEDV病毒复制过程中均有一定的抑制作用,其中直接灭活作用和复制抑制试验效果比较明显,且质量浓度C=100mg/L,与病毒对照相比差异极显著(P<0.01),质量浓度C≥25mg/L,细胞保护率均超过50%。而阻滞试验、吸附抑制试验和穿入抑制试验,药物质量浓度需要达到100mg/L才出现显著的保护作用。表明复方术芩提取液在体外抗PEDV主要是通过对病毒的直接灭活和对病毒复制抑制而达到抗病毒功效。     

紫花地丁黄酮类提取物体外抗传染性支气管炎病毒作用研究

为了在体外研究紫花地丁黄酮类提取物抗鸡传染性支气管炎病毒（IBV—M41）的作用,以鸡胚肾细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应（CPE）与空斑减数试验测定紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性,计算其IC50与治疗指数,并从药物对病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的影响及对病毒穿膜的影响3个方面初探紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性的机理。结果：紫花地丁黄酮类提取物能明显抑制IBV的致病变作用,其IC50为16．52mg／L,TI值为15．76。研究显示,紫花地丁黄酮类提取物在体外对IBV直接灭活的效果明显,在高浓度时对抑制IBV吸附与穿入细胞具有一定作用。结果表明：紫花地丁黄酮类提取物在体外有明显的抗IBV感染作用,且主要是通过直接灭活IBV而发挥作用。     

HPLC法测定整肠舒颗粒中秦皮甲素的含量

目的：测定整肠舒颗粒中秦皮甲素的含量方法：采用TLC法对样品中的秦皮甲素进行定性鉴别，用HPLC法测定样品中秦皮甲素的含量色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，流动相为甲醇-水-磷酸(24:76:0.1)，检测波长为335nm，流速为1.0ml/min.结果：整肠舒颗粒中秦皮甲素浓度在20～100μg/ml范围内线性良好，r=0.9996，平均回收率98.87％(RSD=1.92％，n=6)结论：本方法操作简便、快速、准确，可用于整肠舒颗粒中秦皮甲素含量的测定。     

浒苔多糖体外抗犬冠状病毒临床分离株的作用研究

利用A72细胞(犬纤维肉瘤细胞系)从山东某宠物医院临床上表现为急性胃肠炎症状的幼犬腹泻粪便中分离到1株病毒,通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR进行鉴定,确定为犬冠状病毒,命名为CCoV-SW1。为探讨浒苔多糖(EPS)体外抗CCoV-SW1毒株的作用效果,以A72细胞为细胞模型,通过直接杀灭、抑制复制及阻断吸附3个方面进行研究。结果表明,EPS对A72细胞最大安全浓度为62.5mg/L;EPS对CCoV感染A72细胞抑制率与EPS质量浓度有一定量效关系;EPS对CCoV具有直接杀灭和阻断吸附的作用,并且与EPS浓度具有量效关系;EPS抑制CCoV复制效果不明显,但仍有一定效果,当EPS浓度为62.5mg/L时,细胞存活率为37.2%。EPS在体外对CCoV具有直接杀灭和阻断吸附的作用,为CCoV的预防和治疗提供依据。     

丝兰提取物对体外模拟条件下绵羊瘤胃脲酶活性的影响

本试验采用体外培养法,研究添加不同浓度的丝兰提取物对绵羊瘤胃脲酶活性的影响.分别通过添加0、100、1000、10000 mg/L以及在此基础上细化添加0、100、200、300、500、1000 mg/L的丝兰提取物,测定其对1%尿素分解产生的氨浓度的测定,确定丝兰提取物抑制瘤胃微生物脲酶活性的最佳抑制范围.综合生产成本及使用效果,本试验结果表明,丝兰提取物的浓度为300 mg/L时,对氨浓度抑制效果较好.     

秦皮水提取物与部分西药对含fosA3大肠杆菌的联合作用

本试验初步探讨秦皮水提取物与抗菌药联合诱导含fosA3型耐药基因大肠杆菌传代的体外抑菌活性,为耐药大肠杆菌感染疾病提供治疗参考方案。采用二倍微量稀释法体外分别检测秦皮水提取物与抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并以1/2 MIC的秦皮水提取物与抗菌药联合诱导含(fosfomycin resistance gene,FosA3)型大肠杆菌的传代试验。秦皮水提取物的MIC为1.0g/mL,以0.5g/mL的秦皮水提取物与头孢曲松钠、阿莫西林、诺氟沙星、粘杆菌素、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考和磷霉素11种抗菌药联合诱导传代后MIC显著降低。结果显示:秦皮水提取物联合抗菌药诱导耐药细菌体外抗菌活性明显增强,对含fosA3型大肠杆菌具有耐药逆转作用。     

朱砂七提取物体外抑菌和抗病毒活性部位筛选

为筛选朱砂七提取物体外抑制9株临床分离致病菌和抑制新城疫病毒(NDV)的活性部位,采用琼脂扩散和试管稀释法进行体外抑菌试验,MTT法和鸡胚法测定了朱砂七提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚内增殖的影响.结果显示,朱砂七乙酸乙酯部位(PCE)对9株临床分离菌的MBC均小于100 g/L;朱砂七氯仿部位(PCC)有一定的抑菌作用;大黄素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的MBC分别为5,2.5,2.5,2.5,1.25 g/L;PCE进一步分离部位PCEA对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的MBC分别为24,24,12,6,6 g/L.PCC和大黄素对NDV在CEF上增殖的抑制作用不明显;PCE对NDV在CEF上的抑制率为39.12%(P＜0.01),PCEA对NDV在CEF上的抑制率为72.33%(P＜0.01);PCEA对NDV在鸡胚中增殖具有抑制作用,其预防组和药毒混合组与病毒对照组的血凝效价差异显著(P＜0.05),而治疗组与病毒对照组差异不显著.由此可知,朱砂七提取物具有抑制细菌作用,PCE和PCEA对NDV的增殖具有一定的抑制作用.     

泰山松花粉多糖体外抗鸡传染性法氏囊病病毒的效果

鸡传染性法氏囊超强毒株(vvIBDV)可引起鸡群高死亡率及严重的免疫系统损伤,给养禽业带来巨大的经济损失。为探讨泰山松花粉多糖(TPPPS)体外抗vvIBDV感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)作用机制,以DF-1细胞为宿主细胞,利巴韦林(Ribavirin)为抑病毒对照药物,从TPPPS对病毒的直接灭活作用、阻滞作用、抑制吸附及其复制4个方面探讨TPPPS抗vvIBDV机理。结果显示,在无毒质量浓度范围内TPPPS对vvIBDV的最高抑制率为92.4%,Ribavirin的最高抑制率仅为76.7%;在阻滞试验和抑病毒吸附试验中最高抑制率分别达到91.85%和78.36%;在抑制病毒复制试验和直接灭活病毒试验中抑制率很低,表明TPPPS不能抑制病毒复制和直接灭活病毒。结果表明,TPPPS在体外可有效抑制vvIBDV对DF-1细胞的感染,推测其抗病毒机制是TPPPS预处理DF-1细胞从而结合了病毒颗粒在细胞表面的吸附位点及病毒与多糖直接相互作用抑制病毒吸附细胞,或两种作用同时存在。提示TPPPS可作为预防及治疗超强鸡传染性法氏囊病病毒感染的药物。     

甘草酸二钾体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性

利用细胞病变(CPE)抑制试验和MTT法,通过抗病毒试验来评价甘草酸二钾对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的保护效果,并通过复制抑制、吸附抑制和直接杀灭3个试验探讨了甘草酸二钾体外抑制PRRSV的作用方式.结果表明,在安全浓度范围内,甘草酸二钾能够显著抑制CPE的产生(抑制率≥100％).在直接杀灭和复制抑制试验中均表现出较高的抑制率,但在吸附试验中却没有阻断病毒对细胞的吸附,初步推测甘草酸二钾可干扰PRRSV的复制或可直接将其灭活,或两种作用同时存在.说明在体外试验中甘草酸二钾具有良好抗PRRSV活性,可以作为潜在的抗病毒试剂供进一步研究使用.     

香豆素化合物体内外抗狂犬病病毒的效果

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的一种以侵害中枢神经系统为特征的高度致死性人兽共患传染病,虽然人类尝试了多种方法用于治疗狂犬病,但到目前为止,狂犬病一旦出现临床症状,死亡率仍高达100%,因此,寻找有效的抗RABV药物仍是亟待解决的问题。已有研究显示香豆素化合物(coumarin,CM)具有一定的抗病毒作用,但其对RABV的作用目前尚没有研究。首先以BHK-21细胞为模型,通过SRB、直接免疫荧光(DFA)和病毒滴度等方法,在体外筛选具有良好抗RABV作用的CM,进而从直接灭活、阻滞吸附、不同时间点对病毒抑制效果等方面探讨CM体外抗RABV的作用机制。随后构建RABV感染动物模型,观察筛选获得的CM是否可以挽救病毒感染小鼠。结果显示,CM-3(9种CM分别标记为CM-1～9)可以有效抑制RABV在宿主细胞内的复制,但不能直接灭活病毒,也不能阻滞RABV对宿主细胞的吸附;其在RABV感染48h内均可以显著抑制病毒复制,最高抑制率可达60.0%。另外,结果显示在RABV感染后3～12h内用药,CM-3的抑制效果更为显著,抑制率均为50.0%以上;随后,通过体内试验证实CM-3(50mg/kg)可将感染小鼠的存活率由0%提高至12.5%。综上,结果提示,CM-3可能通过感染后抑制病毒复制的方式发挥抗RABV的作用,而此类结构的CM有可能作为潜在的药物用于狂犬病的治疗。     

Nonapeptide突变体制备及抗新城疫病毒活性研究

以生物工程技术表达及120 g/L SDS-PAGE电泳纯化Nonapeptide突变体,取制备的Non-apeptide突变体进行抗新城疫病毒(NDV)的鸡胚试验、鸡体内抗NDV试验。结果表明,当Nonapeptide突变体基因产物浓度达4μg/mL～6μg/mL,对鸡胚保护率均达到100%,感染鸡胚全部存活;Nonapeptide突变体基因产物浓度大于4μg/mL,对NDV有很好的抑制作用,鸡用药后3 d体内检测不到NDV,低剂量组(2μg/mL)也有较好的抑制NDV作用,鸡用药后5 d体内检测不到NDV。Nonapeptide突变体基因产物具有NDV多克隆抗体相似活性,能够抑制鸡胚中和组织培养中NDV的繁殖,具有中和、抑制NDV吸附作用。     

四种中草药体外抑菌活性及最优组方研究

选取白头翁、马齿苋、大青叶、秦皮4种中草药,分别用水煎煮法和乙醇浸提法提取其有效成分,采用纸片法和微量稀释法测定了各提取物在体外对鸡大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌的抑菌活性和最低抑菌浓度,最后通过正交试验确定了4种提取物体外抑菌的最优组方.结果表明,白头翁、马齿苋、大青叶的水提物对两种试验菌的体外抑菌活性较醇提取强,秦皮的醇提物抑菌活性较水提物强,且差异极显著(P＜0.01).白头翁和大青叶的水提取物对沙门氏菌的最低抑菌浓度最低(0.025 g/mL);秦皮的乙醇提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度最低(0.025 g/mL).抑制大肠杆菌的最优组方为白头翁、马齿苋、大青叶、秦皮的比为4∶1∶2∶2;抑制沙门氏菌的最优组方为2∶2∶1∶4.     

生物表面活性素体外抗病毒活性

测定了表面活性素(Surfactin)的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作用,并对其可能的机理进行了初步的探讨.结果表明,生物表面活性素对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)的TD50和TD0分别为62.5、16.125 mg/L;对猪肾(Porcine kidney,PK-15)细胞的TD50和TD0分别为31.25、4.03 mg/L;对NDV LaSota株、PRV株所致细胞病变效应有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;表面活性素可以直接作用于NDV LaSota株、PRV株,具有一定的抗病毒作用;同时还具有一定的预防NDV LaSota株感染及抑制其复制的作用.但对PRV病毒作用不显著.其抗病毒效果和相应的阳性对照抗病毒药物病毒唑(Ribavirin),无环鸟苷(Acyclovir,ACV)相当,并且由于其细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行开发研究.     

浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒研究

为研究浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的效果,用水煮醇沉法从浒苔中提取浒苔多糖粗品,细胞维持液倍比稀释后,以猪睾丸细胞(ST)为细胞模型,采用细胞病变效应(CPE)试验,通过直接杀灭、抑制病毒复制和阻断病毒吸附3个方面进行研究。结果表明,浒苔多糖对ST细胞最大安全浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖在体外对TGEV作用2h的最小杀灭浓度为0.2mg/mL,作用4h的最小杀灭浓度为0.1mg/mL;浒苔多糖浓度越高对TGEV复制的抑制作用越明显,TGEV感染细胞时间越长,对TGEV复制的抑制作用越低,抑制TGEV复制的最小浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖对TGEV吸附ST细胞阻断作用的最小浓度与浒苔多糖作用于ST细胞的时间有关,2h为0.393mg/mL,4h为0.2mg/mL。浒苔多糖在体外对TGEV具有直接杀灭和阻断吸附的作用,为浒苔多糖抗病毒功能提供了理论依据。