乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析 E蛋白基因结构与功能的关系提供条件     

猪瘟病毒EO蛋白的原核表达及其重组蛋白活性测定

通过重叠PCR合成猪瘟病毒EO基因,将该片段定向插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b／EO,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达,比较不同诱导条件下的蛋白表达,确定其最佳表达条件。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,Ni2 亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法复性。通过方阵试验确定包被抗原的最适工作浓度,为了测定EO蛋白的活性,本文初步建立了检测猪瘟血清抗体水平的间接 ELISA方法,为开发检测猪瘟抗体诊断试荆奠定基础。     

抗人红细胞/抗猪瘟病毒双功能单链抗体的制备及功能鉴定

旨在构建检测猪瘟病毒(CSFV)的双功能单链抗体。通过连接肽将抗人红细胞膜H抗原单链抗体基因2E8-ScFv和抗猪瘟病毒单链抗体基因CSFV-ScFv拼接成融合基因,大肠杆菌密码子优化及人工合成后,构建原核表达载体pCzn1-2E8-CSFV,转化BL21(Plyss)进行重组蛋白IPTG的诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)、ELISA和血凝试验,验证重组蛋白双功能活性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌中表达,分子质量约为55 kDa。IFA和ELISA结果表明,纯化复性后的重组蛋白与猪瘟病毒具有良好的结合活性;红细胞凝集试验表明,重组蛋白能与人红细胞特异性结合,同时也能与猪瘟病毒发生特异性结合,具有双功能特性。本研究成功表达了抗人红细胞膜H抗原/抗猪瘟病毒双功能单链抗体,为进一步构建猪瘟病毒红细胞凝集试验快速检测方法奠定基础。     

猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价

本研究通过基因工程技术,在大肠杆菌中高效表达了含猪瘟病毒E2基因中抗原指数较高且含有中和性抗原域的A1/A2区以及B、C区中抗原性较高、命名为tE2的重组蛋白和猪瘟病毒重复中和表位4P1重组蛋白、4P2重组蛋白,将上述3种重组蛋白和猪瘟活疫苗与白油佐剂混合乳化作为免疫原分别免疫产蛋鸡制备抗猪瘟病毒卵黄抗体,并对抗体效价和对猪瘟病毒的中和作用进行了检测和初步研究。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达

以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。     

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白，并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性，为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段，运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体，构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清，通过间接ELISA方法测定抗体水平，间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示，37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下，E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达，经纯化复性后免疫小鼠，制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白，制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

TAT穿膜肽介导的融合蛋白增强猪瘟病毒对细胞感染效率的研究

笔者使用人工合成TAT-CD46基因,通过T4连接酶将TAT-CD46基因与原核表达载体PET-23a进行连接,经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定,得到重组质粒PET-23a-TAT-CD46。转化大肠杆菌,诱导TAT-CD46融合蛋白表达,Ni-NTA Superflow柱纯化后,将融合蛋白与猪瘟病毒液一起加入培养的ST细胞中,观察荧光进入细胞的情况。经免疫荧光证实,TAT-CD46融合蛋白能够提高猪瘟病毒对ST细胞的感染能力,可以有效促进CSFV在ST细胞中的增殖速率,这为进一步提高猪瘟病毒效价奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区高效表达及间接ELISA抗体检测方法的建立和应用

利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。     

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及免疫原性分析

构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。     

人补体C1INH基因的原核表达及其抗血清的制备

 采用PCR技术获得人补体C1INH基因全长,以其为模板扩增出抗原表位基因片段命名为C1,然后将C1片段重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌;IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21培养物,纯化蛋白后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析表明,pET32a-C1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6 400;Western-blot检测显示,抗血清可与原核表达的C1INH蛋白进行特异性结合,为进一步检测真核表达蛋白及研究rhC1INH的功能活性,并为C1INH的临床检测奠定基础。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.     

布鲁菌IF3蛋白的原核表达及鉴定

布鲁菌病是由细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌布鲁菌引起的一种人兽共患病,以发热、流产为主要症状,严重威胁着人畜健康.以布鲁菌M16基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增出537 bp的布鲁菌IF3蛋白编码基因,并克隆至原核表达载体pET32a( ),成功构建了pET32a-IF3重组质粒,经IPTG诱导,证实目的蛋白以可溶性形式高效表达,利用离子交换层析纯化重组蛋白,纯度可达95%,免疫印迹显示,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为布鲁菌病的诊断和新型疫苗研究奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒牦牛分离株E0基因的克隆表达

将青海牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)青海泽库(QHZK)株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(a),构建了重组表达载体pET-32(a)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠埃希菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预期的蛋白分子质量大小一致;Western blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达

通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。     

猪去乙酰化酶SIRT3的克隆及表达

本试验旨在原核表达猪去乙酰化酶SIRT3,并初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用RT-PCR扩增包含SIRT3的完整编码序列;通过Ω-PCR,将SIRT3完整编码序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达和亲和层析纯化;经免疫印迹分析初步评价SIRT3的抗原性和特异性。重组原核表达质粒pET28a-SIRT3经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约39 ku,能被相关抗体识别。结果表明,本试验成功在大肠杆菌中表达猪去乙酰化酶SIRT3,为对其进行进一步研究奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达与鉴定

参照已发表的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增长约972 bp的E基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。