猪2型圆环病毒核酸疫苗的构建、鉴定和表达

以pVAX1为真核表达载体，以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙古株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因，构建了pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1和pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等4个重组质粒作为核酸疫苗。将这4个重组核酸质粒分别酶切鉴定后，转染BHK-21和PK-15细胞进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blotting检测。结果表明，重组核酸质粒构建正确，并能进行表达。     

猪圆环病毒与口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的鉴定和BALB/c小鼠的免疫试验

以鸡痘病毒(FPV282E4)为活载体,用猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白、与复制相关蛋白基因及O型口蹄疫结构蛋白基因作为目的基因,经同源重组的方法获得2个重组鸡痘毒,分别命名为:vUTALP1-ORF2-ORF1、vUTALP1-ORF2。在复制、转录和翻译水平对这2个重组毒进行鉴定,结果表明这2个重组毒均能表达目的蛋白。将它们免疫6～8周龄BALB/c小鼠,每隔19d免疫1次,共3次;每10d尾跟采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。结果发现2个重组毒试验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清能获得最高的抗体效价,与对照组FPV相比都能产生一定的体液免疫反应,且以vUTALP1-ORF2-ORF1重组毒免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫试验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P0.05),并以vUTALP1-ORF2-ORF1数值较高。结果表明,这2个重组鸡痘毒既能较好的刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫,将作为候选活载体重组鸡痘毒进行本体动物免疫试验研究。     

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。     

共表达新城疫病毒F基因、传染性法氏囊病病毒VP0基因的重组鸡痘病毒的抗原性和免疫原性

以鸡痘病毒(FPV)282E4株TK基因为侧翼,将2个相同的复合启动子ATI@p7.5×20以反向方式连接,分别调控新城疫病毒(NDV)F基因和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP0基因,得到重组转移质粒pVP0-2ATI@p7.5×20F.然后将该重组转移质粒用脂质体转染预先感染FPV 282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF),在经BrdU(5-溴-脱氧尿嘧啶)加压处理后的CEF上传代,用间接免疫荧光试验、Western blot检测,有2株鸡痘病毒能同时表达NDV F蛋白和IBDV VP0蛋白.用这2株重组鸡痘病毒刺种商品Leghorn雏鸡,于刺种前及刺种后1、2、3周对抗NDV特异性抗体水平和淋巴细胞转化能力检测,结果发现,重组鸡痘病毒能激发机体产生良好的免疫反应.结果表明,重组鸡痘病毒可以作为疫苗备选株进行研究与开发.     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因表达的试验

通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。     

牛β-干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛β-干扰素基因的重组新城疫病毒全基因组质粒pFL-BoIFN-β, 与辅助质粒共转染BHK-21细胞后获得表达BoIFN-β的重组新城疫病毒.收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒经RT-PCR检验证实重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射以灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上测定rL-BoIFNβ抗病毒活性, 表达BoIFN-β的重组新城疫病毒能有效抑制重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上的复制, rL-BoIFNβ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×107 IU/mL.结果表明:重组新城疫病毒rL-BoIFNβ接种的SPF鸡胚尿囊液具有高效而稳定的抗病毒活性,重组新城疫病毒可以作为外源蛋白的高效表达载体而广泛应用.     

猪圆环病毒2型重组腺病毒核酸扩增检测标准样品的研制

为研制用于猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸扩增检测(NAT)质量控制的标准样品,本研究将猪圆环病毒2型QD/2014株ORF2连接到缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA上,构建了重组穿梭质粒CMV-PCV-2-ORF2。将其与骨架质粒pacAd5 9.2-100线性化后共转染HEK293T细胞,经胞内重组获得了内含PCV-2-ORF2的重组腺病毒pacAd5 CMV-ORF2。采用PCR和基因测序方法对重组病毒鉴定后进行大量培养、分装和冻干,经均匀性和稳定性检验后对其进行了定值。结果表明,制备的标准样品均匀、稳定,PCV-2-ORF2基因含量为8.17×10~9 GEq/mL,在HEK293细胞上的TCID_(50)为3.56×10~7/0.05 mL。本标准样品的研制成功为核酸检测标准物质制备开辟了一条新途径。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达

猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由ORF2编码。采用PCR技术扩增得到ORF2基因片段,克隆入p UCm-T载体,构建了重组质粒p UCm-PCV2-ORF2。根据p UCm-PCV2-ORF2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体p GEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-ORF2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-ORF2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的GST-PCV2-ORF2重组蛋白具有良好的反应原性。     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

猪圆环病毒2型ORF1、ORF2和ORF3原核表达和多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列，分别设计一对引物，应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段，进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定，同时对插入序列进行测序分析，表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％，pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建，为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中.经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV.重组穿梭质粒用Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒.将构建的重组腺病毒按照每100μL 1×107蚀宽单位(PFU)滴鼻2次免疫6～8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清.用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究.     

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。     

PCV2ORF1、ORF2截短基因原核表达载体的构建及表达

采用PCR方法,从PCV2双拷贝DNA感染性克隆中扩增出PCV2 ORF1和ORF2截短基因,与pQE30原核表达载体分别经KpnI和HandIII双酶切,连接,经鉴定后证明成功构建pQE30-ORF1、pQE30-ORF2原核表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot检测到目的蛋白表达,为研究蛋白功能和单克隆抗体的研制打下了基础.     

猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORFl和ORF2基因的克隆与表达

猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。     

猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap.本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定.将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白.根据文献报道,致病性的PCV-2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX-6p-1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段.通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE结果,重组质粒pPRO-Cap和pPRO-Rep以及pGEX-△Cap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%.将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV-2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX-△Cap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV-2感染用候选抗原.     

融合表达猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因真核质粒的构建及对小鼠的免疫原性

用PCR法扩增出猪圆环病毒2型的Rep蛋白基因（933bp）和Cap蛋白基因（705bp）,将其定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点上,构建真核表达质粒pcDNA-ORF1-ORF2。将构建好的重组质粒pcD-NA-ORF1-ORF2按100μg/只腿部肌肉注射BALB/c小白鼠,同时设pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-（＋）、PCV2全毒疫苗和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第0、7、14、21、28、42天用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖效应,用ELISA法检测小鼠的抗体水平;并于首免后第0、7、14、21、28天测定脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例,对该核酸疫苗的免疫原性进行初步评价。结果显示,重组质粒能诱导鼠体产生较强的细胞免疫和体液免疫,并从免疫后第7天起所测各组数据均显著高于（P〈0.05）或极显著高于（P〈0.01）其他试验组。结果表明,将ORF1和ORF2基因共同用于PCV2核酸疫苗的研发具有很好的前景,为研究新型猪圆环病毒疫苗奠定了基础。