家蚕抗病毒研究取得重要进展

<正>由上海生命科学研究院博士生陈树清和中国农业科学院蚕业研究所侯成香副研究员共同撰写的研究论文"Transgenic CRISPR/Cas9-mediated viral gene targeting for antiviral therapy of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)"(CRISPR/Cas9介导的基因打靶技术获得对核型多角体病毒高抗的转基因家蚕),日前在国际病毒学的权威期刊《病毒学杂志》(Journal of Virolo-     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体杂交型病毒

将家蚕核型多角体病毒 (BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus,BmNPV)的解链酶基因DNA和苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (AutographacalifonicaMultipleNuclearPolyhedrosisVirus,AcMNPV)的基因组DNA共转染到秋粘虫细胞系Sf 2 1,经过累代的筛选获得既能感染家蚕细胞 ,又能感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒HyNPV。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

对家蚕抗核型多角体病毒的研究策略及研究进展

由家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)引发的家蚕血液型脓病是生产上危害最为严重的蚕病之一。国内外学者从研究家蚕的抗病遗传规律、选育对病毒具有抵抗力的家蚕品种,一直到应用现代分子生物学技术研究病毒的基因组、转录组和蛋白组,研究病毒的侵染规律及与蚕体的互作,基于RNAi和CRISPR/Cas9技术培育转基因抗病毒素材等,已经取得了诸多进展。本文系统总结近10年来有关家蚕抗Bm NPV研究在上述各个方面取得的重要成果,并对未来家蚕抗病毒机制研究和抗病毒分子育种趋势以及亟需解决的科学与技术问题进行探讨,以期为不断深入的家蚕抗病毒研究提供参考。     

从野桑蚕分离的NPV与BmNPV、ApNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒(w-BmNPV)进行空斑筛选,纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的基因组DNA为对照,用随机引物进行PCR扩增。结果表明:野桑蚕分离的NPV和BmNPV、ApNPV间存在较大的差异性,通过版本为1.3b的Treecomw软件分析,野桑蚕体内的NPV和BmNPV的同源关系较近,而与ApNPV的同源关系较远。     

BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。     

增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕的主要经济性状调查

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最严重的病原之一,采用传统育种方法培育家蚕抗性品种存在经济性状和抗性呈负相关的矛盾。为了确定转基因方法能否突破该瓶颈,对先前利用家蚕品种大造建立的增量表达内源性抗病毒基因Bmlipase-1的转基因家蚕系统LI-A的主要经济性状进行调查。结果显示,LI-A的4、5龄幼虫逐日体质量及产茧量性状成绩与正常大造之间没有明显的差异,表明转基因抗病毒家蚕系统LI-A在抗性提高的同时,经济性状没有受到影响。     

新型CRISPR/Cas基因编辑系统的研究与应用进展

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated endonuclease Cas)基因编辑系统在生物体基因功能研究领域发挥着重要作用。CRISPR/Cas9作为典型的CRISPR/Cas基因编辑系统,自建立以来已在多个物种的基因组编辑中得以应用。近年来,Cpf1(也称为Cas12a)、Cas12b(也称为C2c1)、Cas13a(也称为C2c2)等新型Cas蛋白不断被发现和鉴定,进一步拓展了CRISPR/Cas系统的靶向范围,促进了CRISPR/Cas系统的应用。本文阐述新型CRISPR/Cas基因编辑系统与CRISPR/Cas9系统的区别以及利用新型CRISPR/Cas基因编辑系统进行生物体基因组编辑的研究进展,以期较为详细地了解CRISPR/Cpf1和CRISPR/Cas12b等新型CRISPR/Cas系统的特征、作用机制及应用优势,为更加高效地利用CRISPR/Cas系统对家蚕基因组进行编辑提供借鉴。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

利用RGR核酶结构拓展家蚕CRISPR基因组编辑系统的应用研究

针对目前家蚕基因组编辑平台在基因组特定位点的靶点选择、多靶点同时编辑等方面的技术瓶颈,利用家蚕卵巢培养细胞系(Bm N)验证含有双核酶结构的RGR(Ribozyme-gRNA-Ribozyme)在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中的应用效果,用以拓展现有CRISPR/Cas9系统的靶点范围。研究结果显示,采用Cas9系统和Cpf1系统,RGR结构在Bm N细胞中具有良好的定点编辑效果,可成功实现对内源、外源靶基因序列的剪切,且对内外源基因具有高效编辑作用,表明RGR结构可应用于家蚕CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑系统。利用RGR结构的自剪切功能不仅可以拓展家蚕基因组靶基因的范围,还为进一步实现多靶点编辑打下了基础。     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术，在向导RNA （gRNA）的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因，实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究，尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒（MDV）基因组以来，短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果，并对其面临的问题和前景进行了展望，以期为后续研究提供重要参考。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

基于BmNPV DNA聚合酶基因对昆虫杆状病毒系统进化的分析

将家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因与2009年3月前完成全基因组测序的49种杆状病毒DNA聚合酶基因进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析，并建立基于氨基酸序列的系统进化树。结果显示，该系统进化树支持将杆状病毒分为鳞翅目核型多角体病毒、鳞翅目颗粒体病毒、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统，且BmNPV与其他大多数核型多角体病毒同源性较高，属于鳞翅目Group I NPVs，与AcMNPV、PlxyNPV亲缘关系最近。     

干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2的转基因家蚕系统构建和抗性检测

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是严重危害家蚕的病原之一。为了探究通过转基因干涉BmNPV非必需基因抑制病毒的增殖,提高家蚕抗性的可行性,选择BmNPV极早期非必需基因ie-2作为靶标,构建转基因干涉载体,通过显微注射获得转基因家蚕系统A4Pie2H-A和A4Pie2H-B。3龄幼虫添食感染BmNPV后,A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫死亡率分别比非转基因对照品种降低19%和24%;定量PCR结果显示A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫体内的ie-2 mRNA表达量分别为非转基因对照品种的50%和20%,病毒DNA含量分别为非转基因对照品种的32%和12%。此外,2个转基因家蚕系统的全茧量和茧层率与正常家蚕品种比较无显著差异。研究结果表明,干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2可以显著抑制转基因家蚕体内病毒的复制增殖,使幼虫死亡率降低。     

家蚕核型多角体病毒lef5基因对病毒基因组复制和转录调控的影响

lef5是杆状病毒的核心基因之一。构建家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef5基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid和补回型病毒lef5-re-Bacmid,研究lef5基因在BmNPV的基因组DNA复制及各时期基因转录调控中的作用。透射电子显微镜下观察lef5-ko-Bacmid转染BmN细胞后不能产生具有侵染活性的病毒粒子(BV)。荧光定量PCR(qPCR)发现lef5基因缺失对病毒基因组DNA的复制没有明显影响,但会导致病毒各时期基因的转录水平显著下降。进一步通过检测由BmNPV多角体蛋白基因(polh)启动子驱动的荧光素酶活性变化,明确lef5基因对polh基因启动子的调控作用,结果表明lef5基因对polh基因启动子有显著的正调控作用。研究结果提示,lef5基因缺失后不影响BmNPV基因组DNA的复制,但会影响病毒早期、晚期、极晚期基因的转录表达。     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316 871     

用家蚕核型多角体病毒DNA基因组转染细胞系NISES—BOMO—15AIIC的有效脂染法

家蚕细胞系(BOMO—15AIIC)(Inoue等,1990),对家蚕核多角体病毒(BmNPV)和对几种质型多角体病毒(CPV)易感,通常用此细胞系来进行各种研究,诸如杆状病毒介导的组蛋白的表达,研究在离体条件下复制时CPVS与BmNPV的相互影响以及在实验室条件下CPV表达载体的发展.所有这些研究都需要使用高效的方法来将病毒基因组转染到细胞之中.