家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

家蚕核型多角体病的抗性机制研究进展

家蚕核型多角体病毒(Bom byx m ori nuclearpo1yhedrosisvirus,Bm NPV)是昆虫病毒史上首先发现的,由Bm NPV引起的家蚕核型多角体病毒病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种。该病在世界养蚕业国家常有暴发,传染性极强,难以控制,危害最为严重在生产上,常造成巨大的经济损失。蚕业界学者多年来一直希望寻找抗病基因、阐明抗性机理、培育抗性品种,目前在很多领域己取得一定的进展。1杆状病毒及其侵染途径1.1杆状病毒分类及其相关基因的研究杆状病毒(baculovirus)是一类单分子双链闭合环状DNA病毒,基因组大小为88-160kb,因病毒粒子呈杆…     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

家蚕AN品系的核型多角体病毒(BmNPV)抗性基因连锁与定位分析

不同家蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的抵抗性存在较大差异。以对Bm NPV感染具有较强耐受性的家蚕品种华康2号杂交组合(F1)累代自交建立AN品系,以Bm NPV多角体悬液对该品系2龄起蚕经口添食的致死中浓度(LC_(50))为2.154×10~9m L~(-1),比对易感品系C108的LC_(50)提高了10~4倍以上。以易感品系C108作为回交亲本与AN品系组配F_1、BC_1、BC_2群体,2龄起蚕用浓度为1×10~8m L~(-1)的Bm NPV多角体悬液浸渍的桑叶饲喂12 h进行抗性遗传分析,表明AN品系对Bm NPV的高度抗性由位于常染色体的1个显性主基因控制。利用SSR分子标记和高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术对BC2F群体进行连锁分析,发现AN品系的Bm NPV抗性主基因位于第27连锁群。依据对BC2M定位群体的600余个个体的HRM分析结果,绘制了遗传总距离为29.1 c M的AN品系抗性主基因遗传连锁图,抗性主基因与S2800-9和S2801-352标记的遗传距离分别为5.2 c M、2.9 c M。通过对添食中等浓度(1×10~7m L~(-1))Bm NPV多角体悬液后存活个体的基因组DNA进行SSR分子标记HRM分析,推测家蚕抗性品系AN还存在多个分布于其他染色体的微效抗性基因。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕核型多角体病毒及抗病种育

本文介绍了家蚕核型多角型体病毒的发现、性状、复制机制以及对家蚕核型多体病毒的防治方法，不同的研究者用不同的材料研究了家蚕对NPV的抵抗性及其遗传规律，得到了不同的结果，我们的研究发现了高抗NPV的蚕特优种质，探明了家蚕对BmNPV抗性的遗传规律，以306和NB为亲本，组配了近等基本系，筛选了与常染色体上抗NPV基因连锁的RAPD分子标记，并以NB为素材，育成了一批新种质。     

家蚕抗质型多角体病毒(BmCPV)的研究进展

由家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus,Bm CPV)感染引发的家蚕中肠型脓病对蚕业生产的危害严重,目前对该病害的防治仍局限于消毒预防。国内外学者希望从筛选的对Bm CPV有较强抵抗力的家蚕品种中寻找抗性基因和分析抗性机制,并通过转基因技术过量表达抗性基因或经RNA干扰病毒侵染增殖关键基因等策略来提高家蚕防御Bm CPV侵染的能力。本文综述家蚕抗Bm CPV研究在上述方面取得的重要进展,并对家蚕抗Bm CPV的分子机制进行分析与讨论,为该领域展开更深入的研究提供较为系统的参考信息。     

常用家蚕病原原接种与纯化技术

蚕病的病原研究和利用越来越深入,就需要能快速、大量地繁殖出较高纯度的病原的方法,供教学和实验使用,现根据本实验室多年来的经验,简单介绍一下常用家蚕病原菌的简易接种和纯化方法,供参考使用。一、家蚕病毒病病毒的收集与纯化家蚕病毒病主要是核型多角体病和质型多角体病两种。 1、家蚕核型多角体病毒(Bm—NPV)     

家蚕微孢子虫与其他蚕病病原的联合感染试验

调查家蚕微孢子虫(Nosema bomycis,简称Nb)分别与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)、家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)、家蚕肠道菌、苏芸金杆菌(Bt)和家蚕白僵菌联合感染家蚕时存在的拮抗情况。结果显示家蚕感染适量Nb后,再以其它病原感染家蚕,都具有一定的降低家蚕微粒子病发生效果,其中以Nb感染家蚕后再感染Bm NPV或Bm CPV的抑制效果较明显,但其他病原或其他感染方式对降低家蚕微粒子病发生的效果不明显。     

家蚕核型多角体病毒云南株(Bm NPV-YN1)对不同龄期家蚕的侵染致病效应

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是主要的家蚕病毒病病原之一,由其侵染家蚕引发的家蚕核型多角体病(血液型脓病)严重影响云南的蚕业生产。测定分离自云南蚕区的Bm NPV株系(Bm NPV-YN1)对家蚕1~5龄幼虫的毒力,并运用"时间—剂量—死亡率"模型模拟分析该病毒株对家蚕各龄幼虫的感染致病力。结果表明,以浓度为1×10~8~1×10~5m L~(-1)的Bm NPV-YN1多角体悬液添食处理后,家蚕各龄幼虫的感病死亡率随添食病毒多角体悬液浓度的降低而下降,添食1×10~7m L~(-1)Bm NPV多角体悬液后第7天,家蚕1~5龄幼虫的累积死亡率分别为100%、76.67%、72.22%、56.67%和26.67%。Bm NPV-YN1对家蚕幼虫的致病力与龄期相关,其敏感程度从高到低排序依次为1龄、2龄、3龄、4龄、5龄。用Bm NPV-YN1多角体悬液添食家蚕1~5龄幼虫后第7天,致死中浓度(LC_(50))估计值分别为4.78×10~4m L~(-1)、5.38×10~5m L~(-1)、2.22×10~6m L~(-1)、7.95×10~6m L~(-1)和3.92×10~8m L~(-1)。在1×10~8~1×10~5m L~(-1)浓度范围内,Bm NPV-YN1对家蚕幼虫的致死中时(LT_(50))与添食浓度相关,对1~4龄幼虫的LT_(50)值随着Bm NPV-YN1添食浓度的降低而增加。研究结果表明,Bm NPV-YN1对家蚕具有较强的侵染致病效应,提示云南蚕区对血液型脓病的防控应以小蚕期为主,同时密切关注各龄期的眠初期。     

家蚕核型多角体病毒对两广二号和桂蚕N2创伤感染的差异性分析

以桑蚕抗性品种桂蚕N2和常规品种两广二号为对象,用昆虫针在蚕体表制造创口接种新采集的核型多角体病毒(Bm NPV),研究它们感染Bm NPV的差异。结果显示两广二号的Bm NPV创伤感染半数致死浓度(LC_(50))为2.46×10~6 PDV/m L,相当于脓病末期蚕血液稀释264倍的值,属于易感品种。而同等条件下桂蚕N2的LC_(50)为2.21×108PDV/m L,相当于稀释不到3倍的值,对核型多角体病毒耐受度显著高于前者,具有很强的抗核型多角体病毒创伤感染的能力。饲养桂蚕N2能显著减少蚕期创伤感染Bm NPV的几率。     

家蚕新品种华康2号在勉县农村试养初报

2014年汉中市勉县从中国农业科学院蚕业研究所引进抗家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)病家蚕品种华康2号进行秋季试养,并与秋蚕生产上推广量较大的两广二号作对照,结果表明:华康2号对Bm NPV病具有较强的抗性,蚕茧产量高,抗逆性强;大区饲养的华康2号与两广二号相比,4龄起蚕结茧率高0.90个百分点,幼虫生命率高0.87个百分点,死笼率低0.65个百分点,茧层率高0.96个百分点,万头产茧量高24.31%,公斤茧颗数少138粒。     

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株对家蚕的亚致死作用测试

病毒对宿主昆虫的亚致死作用是指感染病毒后未死亡的昆虫,其生长发育、生殖等生命活动能力发生了明显变化。为了探明生产上发生家蚕血液型脓病时是否存在病原物家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的亚致死作用,以家蚕品种菁松×皓月的蚁蚕为材料,测试以低于致死中浓度(LC_(50))的Bm NPV-T3多角体悬液添食处理对存活家蚕的亚致死作用。测定Bm NPV-T3对蚁蚕的LC_(50)值为1.41×10~5m L~(-1)。以浓度为10~5~10~3m L~(-1)的Bm NPV-T3多角体悬液给蚁蚕添食后,存活幼虫的体质量显著降低;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的发育历期明显延长,而对蛹期发育历期的影响不显著;10~5m L~(-1)和10~4m L~(-1)多角体悬液添毒试验组的存活幼虫发育至成虫,其产卵量显著低于对照组;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的蛹体质量、全茧量、茧层量、茧层率均受到一定影响,其中对雌蚕的茧层量影响显著。依据上述试验结果初步认为,以低于致死中浓度的Bm NPV悬液给蚁蚕添毒后,对蚕体的生长发育和产茧、产卵性状都具有一定的影响,Bm NPV对家蚕存在亚致死作用。     

家蚕核型多角体病的潜伏病毒的研究

<正> 家蚕核型多角体病毒病(血液型脓病)是家蚕饲养过程中的常见病害之一。对该病的病原、感染途径和防治方法等,国内外科技工作者已进行了多方面的研究,取得很大进展。家蚕感染核型多角体病毒(NPV)后,蚕体内是否存在潜伏病毒,看法不一。有的人认为,潜伏病毒在诱发因子的作用下被激活,使蚕发病;有人不同意,认为蚕感染NPV后,可能发     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析

对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列(Gen Bank登录号:L33180.1),选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1~49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。     

家蚕抗核型多角体病毒病新品种对BmNPV抗性的鉴定

为了明确新选育的抗病品种对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,Bm NPV)的抵抗性能,分别以菁松、皓月、932、芙蓉、7532、湘晖及其杂交种菁松×皓月(正反交)、932·芙蓉×7532·湘晖(正反交)为对照品种,进行了菁松N、皓月N、932 N、芙蓉N、7532 N、湘晖N及其杂交种菁松N×皓月N(正反交)、932N·芙蓉N×7532N·湘晖N(正反交)对Bm NPV的抗性试验。其中新选育的品种分别用Bm NPV多角体浓度为10~9、10~8、10~7、10~6、10~5个/m L的病毒液30μL均匀涂抹于直径2.5 cm的圆形桑叶背面,于2龄起蚕时饲喂家蚕;对照品种的Bm NPV多角体添食浓度相应地降低1个数量级。48 h以后调查各处理区家蚕的发病情况,计算各品种的半致死浓度(LC_(50))。结果表明:新选育的品种及其杂交种对Bm NPV多角体的LC_(50)均超过10~9个/m L,而其对照品种及其杂交种对Bm NPV多角体的LC_(50)均在10~6个/m L水平或更低,2者相差3个数量级以上,新品种对Bm NPV具有很强的抵抗性。     

家蚕核型多角体病毒增殖关键基因的鉴定

选择家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)基因组中可能与病毒增殖相关的8个基因dbp、lef-2、lef-3、lef-7、lef-10、lef-11、p143和vp1054作为候选基因,利用家蚕内源性microRNA骨架构建候选基因的干扰载体,并采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对上述候选基因进行干扰试验,筛选病毒增殖的关键基因,以期为开辟家蚕抗Bm NPV研究新路径打下基础。对8个候选基因的RNA干扰试验显示:干扰lef-7对Bm NPV的增殖没有明显影响;对lef-2和lef-11表达的干扰效率最高,达到90%以上,其中干扰lef-11后病毒对细胞的感染率仅为9.16%,远远低于对其他基因干扰后的感染率。依据试验结果初步确认8个病毒增殖相关基因中,lef-11对病毒增殖的影响最大。     

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。     

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。