家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究

从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位

JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。     

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

家蚕BmE(spl)-like基因的克隆与表达谱分析

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条新的cDNA序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质序列与果蝇Enhancer of split基因[E(spl)]编码的DNA结合转录调控因子bHLH(helix-loop-helix)有较高的同源性,将该基因命名为BmE(spl)-like(Bombyx mori Enhancer of split like)。该基因的ORF长606 bp,编码201个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量22.3 kD,等电点9.7。构建重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like并在E.coli BL21(DE3)菌株中表达BmE(spl)-like蛋白,经亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like并制备了抗体效价1∶25 600以上的多克隆抗体。用qRT-PCR方法检测BmE(spl)-like在家蚕成虫发育期的转录水平最高,结合果蝇同源基因的功能,推测该基因与蚕蛾的翅发育相关;该基因在家蚕5龄幼虫各组织中的转录水平以表皮最高,马氏管中最低。Western blotting检测BmE(spl)-like在家蚕5龄幼虫性腺中的表达水平最高,其次是丝腺、表皮、脂肪体、肠组织,在头部、马氏管和气管中的表达水平极低,与qRT-PCR检测的BmE(spl)-like在各组织中的转录水平有些差异。     

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

家蚕脂质运载蛋白基因BmLip32的特征与表达活性分析

从已构建的家蚕蛹期cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA片断,经生物信息学分析发现其编码框具有脂质运载蛋白(lipocalin)保守结构域,命名为BmLip32基因,GenBank登录号为FJ602775。构建融合表达质粒pET-28a-BmLip32后转化大肠杆菌BL21并诱导表达,将纯化的His-BmLip32融合蛋白免疫新西兰大白兔成功制备多克隆抗体,效价大于1∶12 800。RT-PCR检测结果表明BmLip32在家蚕蛹期转录水平最高,在5龄幼虫头部中的转录水平明显高于其它组织。Western blotting分析结果显示BmLip32在5龄幼虫头部大量表达。免疫细胞化学实验显示BmLip32蛋白存在于家蚕Bm5细胞的细胞质中。推测BmLip32基因是家蚕神经系统发育相关的重要调控基因。     

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株ORF5基因的克隆与序列分析

本试验以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的ORF5基因全长cDNA,结果该分离株ORF5基因编码区长603bp,可编码200个氨基酸。与美洲型代表株VR2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为89.5%和55.7%。推测该辽宁分离株属于美洲型。     

PRRSV SD-1株ORF7基因的克隆、测序及原核表达载体的构建

参照PRRSV ATCC VR2332株基因序列设计1对引物P1、P2,经RT-PCR扩增出PRRSV SD-1株ORF7基因,经与PMD18-T Vector连接后筛选出阳性克隆株测序。把PRRSV SD-1株ORF7 cDNA亚克隆到PQE上构建PQE-N原核重组表达载体。结果表明,PRRSV SD-1株ORF7核甘酸序列与PRRSV ATCC VR2332株ORF7核甘酸序列完全一致,与欧洲株LV符合率为58%。成功构建原核表达载体PQE-N,为N蛋白的研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

家蚕小热休克蛋白基因BmHSP20.8的表达及功能研究

小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。从构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了一条全长764 bp的基因序列(GenBank登录号:AAG30944.1),其开放阅读框(ORF)长561 bp,编码186个氨基酸。用生物信息学方法对此序列进行同源性分析,表明该序列是一条保守性高达85%的家蚕小热休克蛋白20.8(BmHSP20.8),无跨膜结构,主要分布于细胞质。将该序列的ORF与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21进行原核表达,纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清。通过亚细胞定位技术研究BmHSP20.8在正常和热激状态下的家蚕卵巢上皮细胞Bm5和BmN中的变化,结果显示热激后BmH-SP20.8蛋白从细胞质往细胞膜方向迁移。有BmHSP20.8表达的大肠杆菌菌株经48℃处理后,其生存率比未表达BmHSP20.8蛋白的菌株高4倍左右,说明BmHSP20.8蛋白在大肠杆菌中表达能够提高细菌体在高温环境下的生存率。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a/ORF5重叠区的分离

以两个不同基因型的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用SOE-PCR将I型PRRSV的ORF2～5a替换进II型PRRSV的相应区域,旨在将I型PRRSV的5a从ORF5中独立出来进而研究5a蛋白的功能,同时探讨两型PRRSV的结构蛋白结构与功能关系。研究结果表明,I型PRRSV的ORF2～5a序列能稳定存在于嵌合病毒基因组内,表达的相应蛋白能在II型PRRSV中发挥同样功能。本研究首次将PRRSV的ORF5a序列从ORF5中独立出来,为进一步研究5a蛋白的结构与功能提供了理论依据和基础材料。     

PRRSV, the virus

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is a positive-strand RNA virus that belongs to the Arteriviridae family. PRRSV grows in primary alveolar macrophages and in monkey kidney cell lines. The genomic RNA is approximately 15 kb. The genome encodes the RNA replicase (ORF1a and ORF1b), the glycoproteins GP2 to GP5, the integral membrane protein M, and the nucleocapsid protein N (ORFs 2 to 7). A comparison of nucleotide sequences of different strains indicates that European and North American strains represent two distinct antigenic types. Various PRRSV-specific monoclonal antibodies and recombinant structural proteins have been produced. Well-defined PRRSV mutants can be generated with the recently developed infectious cDNA clone of PRRSV.     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

扩展莫尼茨绦虫引发酶蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——引发酶蛋白,全长1269 bp,编码422个氨基酸,属于AE_Prim_S家族。编码蛋白的理论分子质量为47.1598 ku,等电点为4.83。获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。