PP1γ2对树鼩精子成熟和运动性的调控作用研究

为了阐明树鼩精子中是否存在丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1γ2（PP1γ2）及其在附睾精子中的存在形式,进而探究PP1γ2对精子成熟和运动性的调控作用,本试验以树鼩为研究对象,采用Western blotting分析了不同条件下树鼩附睾头和附睾尾精子中PP1γ2的存在形式和磷酸化程度,探讨了双丁酰环腺苷酸（db-cAMP）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）或Ca²⁺对树鼩精子中PP1γ2磷酸化表达水平的影响,并进一步研究了磷酸酶抑制剂冈田酸（okadaic acid,OA）和花萼海绵诱癌素A （calyculin A,CA）对树鼩精子中PP1γ2磷酸化程度的影响及其对树鼩附睾头和附睾尾精子运动度的影响。结果显示,在树鼩附睾头和附睾尾精子中均存在PP1γ2,且在等量的附睾头和附睾尾精子蛋白中,PP1γ2在附睾尾精子的磷酸化程度远高于附睾头精子;db-cAMP、IBMX或Ca²⁺不改变PP1γ2的磷酸化水平;磷酸酶抑制剂OA和CA能明显提高附睾头和附睾尾中PP1γ2磷酸化的程度,且能显著提高精子（尤其是附睾头精子）的运动度（P<0.05）,OA和CA的最佳作用浓度分别为1 μmol/L和10 nmol/L,最佳作用时间分别为15、20 min。本研究结果表明,蛋白磷酸酶PP1γ2对树鼩精子成熟及运动性具有重要的调控作用,其主要通过磷酸化和去磷酸化的变化发挥作用。     

蛋白磷酸酶1γ2及其与精子功能的研究进展

蛋白磷酸酶1γ2(PP1γ2)是精子特异性蛋白磷酸酶,它是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的4种异构体中的一种,它对调控精子的发生和精子的功能具有重要的作用。精子内源性的调节因子糖原合成激酶-3(GSK-3)、蛋白激酶A锚定蛋白4(AKAP4)、sds22及外源性的调节因子花萼海绵诱癌素A(OA)和冈田酸(CA)都能够通过激活和抑制精子PP1γ2来调节精子的发生、运动等相关功能的发挥。作者对蛋白磷酸酶1γ2与精子功能之间的关系进行了综述。     

绵羊附睾液和附睾精子中抗氧化酶活性的研究

本实验旨在研究绵羊附睾不同部位附睾液和附睾精子的抗氧化酶活性变化模式,采集6只10～12月龄、健康小尾寒羊的睾丸,利用ABTS法、WST-8法、NADPH法和酶标仪检测附睾不同部位附睾腔液和附睾精子总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）以及过氧化物酶（POD）活性的变化。结果显示：从附睾头到附睾尾,附睾液中的T-AOC呈上升趋势,其中附睾尾液体中T-AOC显著高于附睾头和附睾体;附睾尾的液体中SOD、GSH-Px和POD活性显著高于附睾头和附睾体,但CAT活性变化不显著。对于附睾不同部位的精子,从附睾头到附睾尾,T-AOC呈上升趋势,其中附睾尾精子中T-AOC显著高于附睾头和附睾体;附睾尾精子中GSH-Px和POD活性显著高于附睾头,但附睾尾精子中SOD显著低于附睾头,在附睾精子中未检测到CAT活性。总之,绵羊附睾液和精子的抗氧化酶活性呈现区域特异性变化,不论附睾液还是附睾精子,在附睾尾部的总抗氧化力明显高于其他部位,说明随着精子不断成熟和附睾环境的变化,储存在附睾尾的精子需具备更高的抗氧化能力。     

不同浓度Ca2+对塔里木马鹿冻融精子体外获能及蛋白酪氨酸磷酸化的影响

为探讨不同浓度Ca²⁺对马鹿精子体外获能的影响,本研究以塔里木马鹿冻融精子为试验材料,将精子分别悬浮于含不同浓度Ca²⁺（0、1.1、2.2、3.5、5.0 mmol/L）的台氏液（sp-TALP液）中,在培养0、2、4 h时,采用金霉素（CTC）染色法评价精子获能状态,采用SDS-PAGE分离精子膜蛋白,进行免疫印迹分析,检测酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平。结果表明,Ca²⁺浓度为1.1、2.2 mmol/L有利于精子活力的维持（P<0.05）,精子获能率极显著高于对照组和高浓度组（3.5、5.0 mmol/L;P<0.01）,精子存活时间最长（P<0.01）,但高浓度Ca²⁺（5.0 mmol/L）对精子活力具有显著抑制作用（P<0.05）,精子获能率极显著低于低浓度组（P<0.01）,精子存活时间最短（P<0.01）;另外,随着培养时间的推移精子发生酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平有所不同,培养2、4 h时,1.1 mmol/L组精子蛋白磷酸化水平极显著高于其他各组（P<0.01）,高浓度Ca²⁺（3.5、5.0 mmol/L）组酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平极显著下降（P<0.01）。结果表明,塔里木马鹿精子体外获能所需的适宜Ca²⁺浓度为1.1 mmol/L,且获能过程中Ca²⁺的存在是必要的。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。     

Toll样受体7/8在公猪生殖系统中的表达及其配体对猪X/Y精子分选效果评价

旨在分析Toll样受体7/8(TLR7/8)在公猪精子及生殖器官中的表达情况，并探讨是否能通过其配体处理的方式分离猪X精子和Y精子。本研究采用qRT-PCR分析3头健康成年公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾以及精子中TLR7和TLR8基因的mRNA表达水平，利用免疫组化检测公猪睾丸和附睾中TLR7和TLR8蛋白的表达，并通过细胞免疫荧光分析其在不同物种(健康成年小鼠、公牛和公猪)精子中的表达情况，将其配体R848与猪精子共孵育，研究其对精子活力以及X/Y精子分离的影响。结果表明，TLR7和TLR8 mRNA在公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾组织以及精子中均表达；免疫组化结果显示，TLR7/8蛋白在睾丸中主要表达于生殖细胞，在附睾中主要表达于柱状细胞微绒毛中；细胞免疫荧光结果表明，TLR7和TLR8蛋白只表达于小鼠和牛X精子尾部，Y精子中不表达，但TLR7和TLR8蛋白在公猪X和Y精子中都表达且表达模式无显著差异，TLR7蛋白主要表达于猪精子头部顶体区域，TLR8蛋白主要表达于猪精子尾部；与对照组相比，用TLR7和TLR8配体R848孵育猪精子后，精子活力降低，但上层精子的性别比例无显著差...     

己烯雌酚对成年仓鼠附睾组织形态的影响

探讨环境内分泌干扰物已烯雌酚(DES)对成年动物附睾组织形态的影响,将DES皮下注射成年仓鼠(剂量为每天1mg/kg)连续1周后,用光镜和电镜观察附睾组织形态的变化,并用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测附睾管上皮细胞和精子的凋亡情况。结果,DES处理后附睾头和附睾尾萎缩,附睾管变细。附睾管上皮细胞形态出现明显的改变,附睾上皮细胞和精子均出现大量凋亡,附睾管管腔内充满发育异常的生精细胞,少见长形精子。结果表明,DES能诱发成年动物附睾形态的改变,这可能是造成成年动物生精障碍的重要原因。     

树鼩卵母细胞的体外成熟培养及体外受精

利用树鼩卵母细胞的成熟培养、体外受精等方法,生产树鼩的试管婴儿,期望通过此路径来实现生产转基因树鼩动物模型。使用促性腺激素进行树鼩超数排卵、TCM199完全培基对卵母细胞进行体外成熟培养、卵母细胞与体外获能的附睾精子进行体外受精、受精卵发育至桑椹胚、囊胚的实验。结果表明,卵母细胞成熟率A级76.7%、B级55.01%、C级17.39%。受精率52%,受精卵采用体细胞共培养与非共培养的分裂率分别为37.14%和9.6%。桑椹胚/囊胚发育率分别为13.57%和0,(P<0.05)。树鼩卵母细胞的成熟培养、体外受精实验方法可行,受精卵在体外能发育到囊胚阶段。     

绵羊精子细胞核质转运蛋白KPNA4的研究

旨在对绵羊附睾头、体和尾部的精子进行蛋白质组学分析,获得差异表达蛋白,对数据进行功能富集分析,挖掘精子发生/成熟关键蛋白质。本研究选择12月龄左右健康的3只雄性湖羊为试验动物,分离附睾并按区域收集精子,3组样本(附睾头部组、附睾体部组和附睾尾部组),每组3个生物学重复,共计9例绵羊精子细胞样本。基于TMT标定定量蛋白质组学分析和R语言等工具,在获取的差异表达蛋白中进行GO和KEGG富集分析,并利用蛋白质免疫印迹(Western bolt)、免疫荧光(immunofluorescence)和流式细胞术(flow cytometry)试验验证结果的可靠性。从22 841个唯一性肽中鉴定到差异蛋白质616种,其中,尾vs头组鉴定出309个差异表达蛋白(上调213个,下调96个);尾vs.体组鉴定出167个差异表达蛋白(上调107个,下调60个);体vs头组鉴定出140个差异表达蛋白(上调88个,下调52个)。根据差异倍数与蛋白质功能,筛选出可能与精子成熟、核质物质转运相关的关键蛋白-KPNA4。本研究揭示了绵羊附睾不同部位精子的特点与差异,这些数据为研究雄性绵羊的生殖机制和精子成熟提供了丰富的资源。     

参与调节哺乳动物精子运动的离子通道研究进展

精子运动能力是精子完成自然受精、实现自然条件下精子-卵母细胞融合的必要条件。精子从雄性附睾经生殖道进入雌性生殖道的过程中，其运动形式可以在很短的时间内根据环境的变化而做出改变，表明精子膜蛋白(离子通道)参与精子运动的调节，离子通道的正常表达和受精过程密切相关。目前研究发现Ca²⁺、K⁺、Na⁺等离子通道均参与精子膜极化、运动、获能和顶体反应等生理过程，且通过膜片钳和电生理学等技术初步了解精子离子通道的作用分子机制和拓扑结构。本文就参与调节精子运动的Ca²⁺、pH、电压门控Na⁺、K⁺、Cl^-通道的生理功能和拓扑结构进行了总结，期望能为精子离子通道的调节机制和功能研究提供全面的信息，促进动物生殖生物学的发展。     

绵羊附睾褪黑素受体1的表达与定位

为研究褪黑素受体1（MT1）在不同年龄绵羊附睾中的表达模式，选用幼龄绵羊（2~3月龄）、青年绵羊（6~8月龄）和成年绵羊（2~3岁）的附睾，采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测不同年龄绵羊附睾各部位MT1基因mRNA的表达量和MT1的分布情况。结果表明：幼龄绵羊附睾尾MT1基因的转录水平极显著高于附睾头和附睾体（P<0.01）；青年绵羊附睾体和附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头（P<0.05）；成年绵羊附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头和附睾体（P<0.05），附睾各部位MT1基因的转录水平随年龄增长呈明显降低趋势；定位结果显示，MT1在各年龄组绵羊附睾的各个部位均有分布，且主要分布在附睾上皮细胞中。综合上述结果，不同年龄绵羊附睾的不同部位均有MT1表达和分布，并随年龄增长各部位的表达量降低，相同年龄绵羊附睾尾MT1的表达水平较高。     

钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化调节作用研究

钙离子(Ca2+)参与哺乳动物精子获能、超激活运动和顶体反应等多个生理过程,但其作用机理尚未明确。本研究旨在探讨Ca2+在猪精子获能过程中对精子活力和蛋白磷酸化的影响及其作用机制。采用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)及蛋白免疫印迹方法测定不同Ca2+浓度处理后精子活力参数及蛋白磷酸化水平变化,同时,利用细胞免疫荧光技术对不同处理组精子样品磷酸化蛋白进行细胞亚组分定位。CASA结果显示,随着Ca2+浓度增加,猪精子活力参数呈现先增加(1.0 mmol/L)后降低(3.0 mmol/L)的趋势;免疫印迹结果发现,低浓度钙离子(0.5 mmol/L)促进精子蛋白磷酸化,而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)显著抑制蛋白磷酸化;免疫荧光揭示,4.0 mmol/L钙离子处理组鞭毛处磷酸化蛋白明显少于未获能组和获能组;c AMP-PKA信号通路调节因子c AMP和IBMX以及钙调蛋白抑制剂W7和CZ均能有效缓解高浓度钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的抑制作用。结果提示,钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化起双重调节作用:即低浓度钙离子(0.5 mmol/L)有助于提高猪精子活力及蛋白磷酸化,高浓度钙离子(4.0 mmol/L)抑制精子活力和蛋白磷酸化;而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)可能通过c AMPPKA信号通路和Ca2+/Ca M通路抑制鞭毛处与精子活力有关的蛋白(动力蛋白或轴丝蛋白)磷酸化,进而抑制精子活力。     

L—PGDS基因在大鼠睾丸与附睾中的表达

选用2月龄SD大鼠睾丸与附睾总RNA为模板，运用RT—PCR和蛋白质印迹技术探讨了Lipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS)基因在大鼠睾丸与附睾头、附睾体和附睾尾中的表达及其差异。结果表明，L—PGDS基因在大鼠睾丸中没有表达，在附睾中有较强表达，附睾头表达量最高，附睾体次之，附睾尾最低，表达量存在差异。提示，L-PGDS在精子成熟过程中起着一定的作用。     

绵羊附睾褪黑素受体1的表达与定位

为研究褪黑素受体1(MT1)在不同年龄绵羊附睾中的表达模式,选用幼龄绵羊(2~3月龄)、青年绵羊(6~8月龄)和成年绵羊(2~3岁)的附睾,采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测不同年龄绵羊附睾各部位MT1基因mRNA的表达量和MT1的分布情况。结果表明:幼龄绵羊附睾尾MT1基因的转录水平极显著高于附睾头和附睾体(P0.01);青年绵羊附睾体和附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头(P0.05);成年绵羊附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头和附睾体(P0.05),附睾各部位MT1基因的转录水平随年龄增长呈明显降低趋势;定位结果显示,MT1在各年龄组绵羊附睾的各个部位均有分布,且主要分布在附睾上皮细胞中。综合上述结果,不同年龄绵羊附睾的不同部位均有MT1表达和分布,并随年龄增长各部位的表达量降低,相同年龄绵羊附睾尾MT1的表达水平较高。     

碱预处理精子在牛ICSI上的应用

利用50 mmol的NaOH溶液分别处理牛精子30 min和1 h,显微镜下发现处理30 min精子尾部缩短1/3,处理1 h精子尾完全消失,仅留精子头。为了比较2种不同结构精子对胚胎发育的影响,对2组不同结构精子分别实施单精子注射,比较2组精子对胚胎发育的影响,通过差异染色比较胚胎发育质量,以制动精子作为对照。结果表明:①精子头组操作成功率高于缩尾精子组(P>0.05)和制动精子组(P<0.05);②缩尾精子组的卵裂率显著高于精子头组(P<0.05)和制动精子组(P<0.05),且桑囊率也显著高于制动精子组(P<0.05);③差异染色表明,缩尾精子组胚胎的细胞数和制动精子组胚胎的细胞数均显著高于精子头组(P<0.05)。因此,利用50 mmol的NaOH处理牛精子30 min,选择缩尾精子实施单精子注射,能提高胚胎操作效率和胚胎发育质量。     

还原型谷胱甘肽对氟中毒小鼠附睾的影响

试验旨在研究还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)对氟中毒小鼠附睾的影响。将50只3周龄ICR雄性小鼠随机分为5组,分别为对照组和4组染氟组。对照组饮用蒸馏水,染氟组分别供给含100mg/L NaF的蒸馏水,自由饮水30d。之后在染氟组中选择3组每日分别灌胃200、400和800mg/(kg·只)GSH,同时各组小鼠再自由饮含氟水30d。试验结束后,摘取小鼠附睾进行活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、GSH含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测,同时制作石蜡切片,HE染色后进行组织形态结构分析。结果显示,与对照组相比,100mg/L NaF组精子密度、精子活力、GSH含量、GPx和GR活性均显著下降(P0.05),而GSH添加组较100 mg/L NaF组均有所升高;100 mg/L NaF组精子畸形率、ROS和MDA含量较对照组均显著升高(P0.05),而GSH添加组较100mg/L NaF组均降低,其中800mg/kg GSH组效果明显。与对照组相比,100mg/L NaF组附睾头、附睾体及附睾尾管腔厚度升高,管腔内精子数量下降;GSH添加组附睾头、附睾体及附睾尾的管腔厚度与管腔内精子数量都有所恢复,其中800mg/kg GSH组效果较好。综上所述,添加GSH后氟中毒小鼠谷胱甘肽抗氧化系统酶活性有所升高,附睾组织形态结构一定程度上有所恢复,对附睾有一定的改善作用。     

水牛附睾尾精子的体外受精

采用肝素诱导获能 ,比较了 TAL P液和 BO液处理水牛附睾尾精子进行体外受精和细管冷冻精液体外受精的效果。结果表明 ,用 BO液和 TAL P液分别处理水牛附睾尾精子 ,受精后的卵裂率分别为 4 6 .6 7%和 5 3.73% ,发育率分别为 2 1.6 7%和 2 6 .87% ,其受精效果差异不显著。综合 2种方法 ,水牛附睾尾精子的受精率为 5 7.14 % ,受精后的卵裂率为 5 0 .39% ;发育率相对于培养卵为 2 4 .4 1% ,相对于卵裂卵为 4 8.4 4 % ;与细管冷冻精液 (5 6 .0 0 % ,5 4 .31% ,2 6 .72 % ,4 9.2 1% )相比 ,差异不显著。形态学观察还表明 ,用保温干储的方法可获得活率好、存活时间长的附睾尾精子。试验结果说明水牛附睾尾精子用于体外受精可以得到与细管冷冻精液相当的效果。     

精子受精抗原-1(FA-1) mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达

本研究通过RT-PCR检测了该基因在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。首先,提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA,以此为模板,反转录合成cDNA,自行设计引物,PCR扩增出462 bp的目的DNA。然后,将目的片断克隆入T载体,通过菌液PCR和重组质粒酶切,鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片断。同时,以β-actin为内参照物,进行RT-PCR半定量分析,比较精子受精抗原(FA-1)在睾丸、附睾头、体、尾组织中的表达量。结果表明,FA-1在绵羊睾丸和附睾中均表达。     

公山羊β防御素124的表达谱分析及其在繁殖器官中的定位

旨在研究公山羊β防御素124(Goat beta-defensin 124,gDB 124)的表达谱及其蛋白在繁殖器官中的分布特点。采集1周龄、2~6月龄公羊各3只(体重相近)睾丸和附睾,以及18月龄公山羊睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、心、肝、脾、肺、肾和背最长肌组织。用qRT-PCR分析gDB124mRNA的表达情况;采用免疫荧光技术分析睾丸、附睾头、附睾体和附睾尾gDB 124分布特点。结果显示:除背最长肌中无表达外,gDB124mRNA在18月龄公山羊睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、心、肝、脾、肺和肾组织均有表达,且附睾头表达量极显著高于其他组织(P0.01);睾丸gDB124mRNA表达量6月龄时显著高于其他月龄;附睾头、附睾体和附睾尾gDB124mRNA表达量随月龄的增加呈上升趋势;1周龄公山羊睾丸和附睾gDB124mRNA表达量不存在显著差异,3、4、5、6、18月龄时附睾头gDB124mRNA表达量显著高于睾丸、附睾体和附睾尾(P0.05);免疫荧光定位技术分析显示:gDB 124在公山羊睾丸和附睾中均有分布,但主要是在附睾头上皮细胞中。根据荧光信号强度gDB 124的表达量顺序:附睾头附睾体附睾尾睾丸,该结果与qRT-PCR分析结果相一致。公山羊gDB124mRNA表达具有明显组织特异性和时间依赖性。     

高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊附睾组织中eNOS差异表达研究

采用免疫组化SP法结合IPP统计分析法,比较高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊附睾组织中eNOS的定位及分布特征。平均光密度数据统计表明,eNOS的平均光密度值在藏绵羊附睾尾部显著高于附睾头和附睾体(P0.05),藏绵羊附睾头和附睾体之间无显著差异(P0.05),但在小尾寒羊附睾体显著高于附睾头(P0.05)。小尾寒羊附睾体的平均光密度值显著高于藏绵羊(P0.05),附睾头和附睾尾之间无显著差异(P0.05)。结果表明,eNOS的活性在附睾尾部最高,提示NO与精子运输相关,对于高原地区不同品种绵羊附睾中eNOS分布较大差异的原因尚需深入研究。