IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1461bp的VP2基因，将其克隆于pET-28a载体，筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导，在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku的蛋白，SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示，VP2表达产物以包涵体形式存在，可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性，用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测，结果，复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍；用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA，结果显示，VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3c7反应强（＋＋＋）；与4E4、1H11反应中度（＋＋）；与4E5、3C4、1E11、3H9反应较弱；而与EC6、3D12、1A1无反应。     

Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达

将Asia Ⅰ型口蹄疫病毒YNBS／58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体pET-28a中，转化BL21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白VP1-BoIFN—α-在大肠埃希氏茵BL21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和western-blotting分析，重组的VP1-BoIFN—α蛋白分子质量约为46ku，与预期大小相符。薄层扫描分析显示，重组蛋白VP1-BoIFN—α的表达量占茵体总蛋白的30％，且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用8mol／L尿素溶解后，在变性条件下利用Ni—NTA柱对VP1-BoIFN—α-融合蛋白进行了纯化。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。     

水貂细小病毒VP2基因的可溶性表达优化及包涵体蛋白复性研究

为探究水貂细小病毒(MEV)VP2蛋白的结构和功能,对MEV VP2蛋白进行原核表达并纯化,用ELISA初步评价重组蛋白在血清学诊断中的价值。通过大肠埃希菌表达外源基因的方法构建MEV VP2原核表达体系,经诱导表达得到以包涵体形式存在的目的蛋白,对蛋白进行纯化、透析复性并鉴定;加入分子伴侣pTf16质粒构建共表达系统,优化表达条件以提升可溶性目的蛋白的表达量,对表达产物进行纯化及鉴定。将纯化后的可溶性蛋白、复性后的包涵体蛋白及纯化后的全病毒蛋白作为抗原包被酶标板,用间接ELISA方法对MEV标准阴、阳性血清进行检测,初步对比评价3种抗原的血清学诊断价值。结果表明,经过双酶切和测序鉴定,成功构建重组蛋白原核表达载体;重组VP2蛋白的分子质量约为67ku;优化诱导温度和诱导试剂浓度未能解决包涵体表达问题;构建了共表达系统,优化表达条件后可溶性目的蛋白的表达量得到明显提高;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,两种重组蛋白皆具有良好的反应原性;间接ELISA结果表明可溶性表达蛋白更适合作为MEV的候选诊断抗原。通过分子伴侣共表达和包涵体蛋白复性的方法获得了大量有活性的目的蛋白,为建立水貂细小病毒血清学诊断方法和制备MEV病毒样颗粒(VLPs)及VP2蛋白多克隆抗体奠定了基础。     

鸡白细胞介素-2原核表达与生物学活性初探

根据pGEX-6p-1表达载体多克隆位点,设计带有限制性内切酶酶切位点的IL-2引物,RT-PCR克隆获得目的基因,连接pGEM-T载体,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、测序和双酶切鉴定,与pGEX-6p-1表达载体连接,转化BL21感受态细胞,经双酶切和PCR鉴定,用IPTG诱导表达,通过菌体裂解、包涵体洗涤、溶解、复性、Sepharose 4B柱层析,SDS-PAGE和Western blot检测,证明表达并纯化了IL-2融合蛋白,而且纯化的IL-2融合蛋白具有促进淋巴细胞增殖的特性.     

鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。     

大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌，高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV3AB非结构蛋白进行纯化，经SDS—PAGE分析，3AB融合蛋白纯度达90％以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性，通过Westernblotting分析，表明复性后的3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明，复性后的3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的体外表达鉴定与蛋白结构分析

口蹄疫病毒为小RNA病毒科属的成员。其基因组为一约含8500个核苷酸的正链RNA，只有1个开放阅读框，编码1个原始翻译产物，该产物可被蛋白水解酶裂解为几个分子量较大的前体，包括P1、P2、P3、P4等。P1又可被病毒编码的蛋白水解酶裂解为VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白单位。由于VP1暴露于病毒颗粒的表面，所以研究工作最多的是VP1。该基因位于FMDV基因组的2977～3615核苷酸，编码213个氨基酸。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。     

重组Gallinacin-3的克隆及在大肠杆菌中的表达

防御素是昆虫、植物和动物体内抗感染及激发特异性抗感染免疫的重要抗菌肽。Gallinacin-3（gal-3）可能是鸡体内最重要的β-防御素，但它的功能还未得到研究证实。本试验从鸡黏膜表皮组织中克隆了gal-3编码基因，并在大肠杆菌中成功表达了gal-3与谷胱甘肽转硫酶（GST）融合蛋白。经IPTG诱导后，融合蛋白的产量占细菌总蛋白的33．6％左右，主要以包涵体形式存在。用亲合层析技术从大肠杆菌裂解液中纯化出可溶性重组蛋白，并用酶切除目标蛋白的融合伴侣。抑菌试验发现，重组gal-3-GST融合蛋白在未去除融合伴侣时，就与游离的gal-3有着相同的抑菌活性，对沙门氏肠炎杆菌和志贺氏痢疾杆菌的最小杀菌浓度在20μg／mL（相当于约4μg／mL纯gal-3）左右，与其他物种β-防御素的活性相当。     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

口蹄疫病毒蛋白对先天免疫的影响

正口蹄疫病毒(FMDV)抑制宿主的翻译机制,阻断蛋白质分泌,并裂解与信号转导和先天免疫应答有关的细胞蛋白。FMDV是一种单链阳性RNA病毒,由衣壳和核酸组成,其基因组长度约为8500个碱基,该基因组被一个二十面体衣壳包裹,衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白各60个拷贝组成(图1)。VP1、VP2、VP3折叠成一个八链的楔形β-折叠形成外层     

美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化

对原核中以包涵体形式高效表达的美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段进行了变性、复性与纯化研究。将美洲型PRRSV重组质粒pGEX-6P-1-N转化入E.coliBL21(DE3)细胞中,成功表达了重组蛋白GST-N,超声裂解复性后目的蛋白经GSTrap FF纯化试剂盒纯化后,纯度可达90%以上。将欧洲型PRRSV重组质粒PQE30-N转化入E.coliM15细胞中表达了重组蛋白His-N。超声裂解后目的蛋白经HisTrapHP蛋白纯化试剂盒纯化后,纯度可达95%以上。Western blot结果表明,两种蛋白分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清识别。纯化出的大量美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段,为PRRSV的鉴别诊断提供了抗原基础。     

新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达

应用PCR方法扩增新型鸭细小病毒(NDPV)VP3基因,将其克隆至原核表达载体pQE1中,获得重组质粒pQE1-VP3。重组质粒pQE1-VP3经优化诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析并利用His标签抗体对表达的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,NDPV VP3蛋白在25℃、IPTG浓度为1.0mmol/L经诱导5h,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为60ku,主要以不溶性包涵体形式存在。纯化复性后,可获得浓度为5.165 mg/mL及纯度为97%的VP3蛋白。获得的重组菌pQE1-VP3以及高纯度的VP3蛋白,为进一步研究NDPV检测方法和新型疫苗奠定了基础。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

鸡β2-微球蛋白的基因克隆与原核表达

本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m 基因全长片段，然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（＋），转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG对其进行诱导表达，利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示，采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp，编码120个氨基酸，与基因库公布的相一致，同源性为100%；经0.8 mM IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清；利用His标签纯化该蛋白， SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带；Western-blot分析表明，纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实，本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白，为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。