芒果细菌性角斑病菌对芒果酚类代谢的影响

【目的】由柑橘黄单胞菌芒果致病变种引起的芒果细菌性角斑病是芒果生产上的重要病害,为探讨芒果感染细菌性角斑病过程中芒果叶片内酚类代谢的变化规律,【方法】以细菌性角斑病高抗品种红杧6号和高感品种贵妃杧为试验材料,测定了接种病菌(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae,XCM)后芒果叶片内总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素含量及酚类代谢相关酶(PPO和PAL)活性的变化趋势。【结果】接种病菌后,感(贵妃杧)、抗(红杧6号)芒果品种体内酚类物质均发生明显的变化。总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素含量、PAL和PPO活性在接种病菌后均直线上升,但总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素含量增幅抗病品种较高,且感病品种在侵染后期总酚和类黄酮均迅速降低；而PAL、PPO活性感病品种增幅较高。【结论】相关性分析表明芒果叶片的总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素含量与芒果抗性呈正相关,而PAL、PPO活性与抗病性呈负相关。     

杧果MiNPR1抗病基因克隆及生物信息学分析

NPR1是SA介导的植物抗病通路中的转录共激活因子。本实验采用RT-PCR技术从杧果（Mangifera indica）中分离得到了MiNPR1-1和MiNPR1-2。序列分析显示：MiNPR1-1基因编码471个氨基酸，MiNPR1-2基因编码445个氨基酸。2种MiNPR1蛋白皆含BTB/POZ结构域和锚蛋白重复序列，非跨膜蛋白且无信号肽，为不稳定酸性亲水蛋白。蛋白结构预测表明：MiNPR1蛋白由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠构成，三级结构与二级结构相符。进化关系得出：MiNPR1-1为单独分支起源，MiNPR1-2蛋白与阿月浑子（Pistacia vera）的XP_031280798.1聚类为一簇。本研究克隆了杧果NPR1基因，预测其编码蛋白特征，为后续研究该基因在杧果上的功能及培育杧果优良抗病品种提供参考。     

杧果细菌性干枯病病原菌的分离与鉴定

细菌性干枯病是发生在广东杧果产区杧果上的一种新病害，为明确引起该病的病原菌种类，通过稀释涂布法分离和纯化、致病性测定、并结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该病原菌进行鉴定。结果表明，从杧果干枯病病样中分离获得的NY01菌株，革兰氏染色呈阴性、菌体杆状。最适温度28℃，最适pH为7.0～7.2。刺伤接种到健康杧果叶片，4天后在杧果的叶片呈现典型病斑。以NY01菌株的DNA为模板，扩增获得的16S rDNA片段，经BLAST分析，NY01菌株16SrDNA序列与Sphingomonas sanguinis（登录号KT766073）的亲缘关系最近，同源性达到99.63%。经形态学、生理生化及16S rDNA序列分析将杧果细菌性干枯病病原菌NY01菌株鉴定为血红鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sanguinis），血红鞘氨醇单胞菌能够引起杧果细菌性干枯病在国内属首次报道。     

芒果细菌性黑斑病研究现状及展望

细菌性黑斑病严重影响芒果产量和商品质量, 是芒果生产上的重要生物灾害之一。该病由野油菜黄单胞菌芒果致病变种（Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae）引起，几乎遍布热带亚热带芒果产区，常造成严重经济损失。本文主要综述了芒果细菌性黑斑病的症状、分布与危害、发生规律、防治方法、病原及其遗传多样性和检测技术等方面的研究进展，以期为该病的进一步研究及有效控制提供参考。     

猪IP-10蛋白真核表达载体的构建

根据GenBank上发表的猪IP-10蛋白的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片段,将扩增产物连接到表达载体pcDNA3.1上,进行序列测定和分析。结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为312bp,共编码104个氨基酸。该基因片段与已发表的猪IP-10蛋白基因核苷酸序列同源性为100%,氨基酸同源性为100%。本试验为重组猪IP-10蛋白的生产及功能研究奠定了基础。     

牛杀菌／通透性增加蛋白氮端基因克隆和序列分析

目的克隆杀菌/通透性增加蛋白(BPI)cDNA,构建重组体pGEM-T-easy-BPI,进行序列鉴定。方法应用RT-PCR技术,参照Genbank报道的序列,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白238个氨基酸,并与pGEM-T-easy连接,构建基因重组体,进行序列测定.结果获得长度为713bp的活性基因。序列分析证实该片段中有1个点突变,但氨基酸序列相同。结论:成功克隆出BPI基因,经序列测定,确认为牛BPI基因,为进一步表达该基因奠定了基础。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

盐生植物盐地碱蓬质膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因片段的克隆及其序列分析

为研究盐地碱蓬(Suaeda salsa)Na+长距离运输的分子机制,根据其他植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1基因的保守序列设计一对简并引物,以盐地碱蓬根系总RNA为模板,采用RT PCR方法克隆出SOS1基因片段,以期为盐地碱蓬SOS1全长基因的克隆、表达调控等研究奠定基础。序列分析结果表明,该基因片段长度为736 bp,编码244个氨基酸;该序列与其他高等植物SOS1核苷酸序列的同源性在74%以上,氨基酸序列同源性则在61%以上。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

林蛙嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆、分析及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用PCR方法,扩增出与预期设计的740 bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为740 bp,共编码246个氨基酸.该基因片段与已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列同源性为98.78%,氨基酸同源性为98.78%.利用生物信息学和分子生物学软件,对嗜水气单胞菌外膜蛋白的结构进行预测,结果表明其为外膜孔蛋白.本试验为嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。     

新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建

为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。     

中国黄牛PrPc成熟蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的PrP^c蛋白基因序列，设计合成一对引物，并在2个引物的两端分别加入Bam HI和Nde Ⅰ酶切位点。以从中国黄牛肝脏中提取的基因组DNA为模板，经PCR扩增出一约640bp的目的基因片段，将此基因克隆于pET11a载体，构建了PrP^c蛋白基因重组质粒b-pET11a-PrP^c，转化DH－5α并进行序列测定。同源性分析表明：中国黄牛PrP^c成熟蛋白基因与目前国外发表牛的成熟蛋白PrP^c基因相比，有较大差异，发现了一个新的NdeⅠ酶切位点；推导的氨基酸序列有4个氨基酸差异，缺少一个8氨基酸重复区。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

芽孢杆菌CY1—3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3A Ⅰ部分消化后回收2～7 kb片段,构建了部分文库.通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1.经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框（ORF）,命名为celC.经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白.氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的β-1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性.粗酶液的SDSPAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku.     

基于mtDNA-COI序列的杧果象甲遗传特性分析

对13份杧果食叶性象甲和5份杧果果核象甲mtDNA-COI序列进行序列特征及同源性分析，结果表明，杧果象甲mtDNA-COI基因序列长度611~658 bp，平均碱基组成为A 29.78%、T 35. 60%、G 15.93%、C 18.70%，碱基A+T含量显著高于G+C含量，表现出明显的A+T偏好性特点。NJ系统发育树将18只杧果象甲分为2大类群，象甲1-4、1-6与其他象甲亲缘关系较远，组成类群I，其余16只象甲组成类群II，其中象甲1-2与5只杧果果核象甲的遗传分歧最小，结合形态特征鉴定其为杧果切叶象甲，它们共同组成亚类群IIa，其余10只象甲之间亲缘关系相近聚为亚类群IIb，表明18只杧果象甲虫之间存在不同程度的遗传分歧。研究证实了mtDNA-COI基因多态性在一定程度上能够反映出杧果象甲之间的相似性和差异性，适用于杧果象甲物种鉴定和系统发育分析，可为进一步开展杧果象甲的分子生物学研究奠定基础。     

副猪嗜血杆菌OMP P2基因的克隆与表达

利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列（ZP_02477753）设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因（OMP P2）,并克隆到载体pMD18-T（T-Vec-tor）,序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。