超量表达益母草种子抗菌蛋白提高番茄的抗病性

为了验证来自益母草Leonums japonicusHoutt种子的抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2对植物病害的广谱抗性,用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法,将其分别转入台湾圣女番茄品种。结果显示,利用黄萎病菌毒素浸泡番茄离体枝条,处理24h,空载转基因对照和非转基因再生植株枝条全部萎蔫,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄T0代枝条未出现萎蔫的株系比率分别为11.11%和6.25%;用离体叶片接种菌块,分别对T0代抗或耐黄萎病菌毒素的T1代株系接种早疫病菌,接种10天,空载转基因对照和非转基因再生植株的病情指数达到100,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄病情指数最低的株系分别为17.5和10.0,表明转基因番茄能同时提高对黄萎病菌毒素和早疫病的抗性;进而用叶盘法检测转基因植株对番茄青枯病菌的抑制作用,结果显示对真菌病害抗性强的转基因植株叶片对青枯病菌的抑菌圈更大。转基因番茄抗病鉴定结果表明,来自益母草种子的LjAMP1和LjAMP2基因对植物病害具有广谱抗性。     

关于CMV-CP基因番茄植株的抗病表现

黄瓜花叶病毒病(CMV)严重危害番茄生产,降低番茄产量和质量。目前,CMV-CP基因转化番茄在国内外获得成功,已得到抗CMV的转基因番茄植株。本试验以带有CMV-CP基因的番茄品种80-2-1为试材,不带CMV-CP基因的80-2-1作对照,参照JeffersonR.A.方法,研究转基因番茄R1～R4代植株对CMV的抗病表现及外源标志基因的表达。转CMV-CP基因的番茄植株对CMV侵染表现显著的抗性,温室中接种的植株无症率为:R1代94%,R2代95.1%,R3代95.4%,R4代95%;大田中自然发病的植株无症率为:R2代65.6%,R3代76.9%。在转基因的番茄植株中,外源基因GUS(β-gluc…     

酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。     

植物激活蛋白对番茄抗病性的诱导作用

用2μg.ml-1植物激活蛋白处理番茄植株,测定了番茄叶片过氧化物酶、过氧化氢酶活性和过氧化氢的含量。处理番茄4d后,过氧化物酶活性比对照增加117.14%;10min过氧化氢酶活性即迅速上升为对照的2.5倍,12h其活性显著低于对照;过氧化氢含量随过氧化氢酶活性的降低逐渐增加,在36h达最大值134.67μmol.g-1,比对照提高27.5%。通过半定量RT-PCR方法测定了参与蜡质合成基因Cer1表达水平,结果表明,处理番茄2d后Cer1表达量约为对照的2倍。植物激活蛋白处理番茄植株,对灰霉病的防治效果21d时达71.30%。     

球孢白僵菌定殖提高番茄对灰霉病抗性及其作用机理

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana定殖对番茄植株抗病性的影响及作用机理,采用灌根法将球孢白僵菌芽生孢子悬浮液接种于番茄植株内,并通过人工接种灰霉菌Botrytis cinerea评价球孢白僵菌定殖后番茄对灰霉病的抗性水平;检测灰霉菌胁迫下番茄植株不同位置叶片内球孢白僵菌的相对含量;测定番茄叶片内草酸氧化酶（oxalate oxidase,OXO）、几丁质酶（chitinase,CHI）和ATP合成酶（ATP synthase,atpA）3种抗病相关基因的表达量。结果表明,球孢白僵菌定殖能够提高番茄植株对灰霉病的抗性,接种灰霉菌第5天,番茄植株发病率、病斑直径和病情指数分别下降了61.6%、41.4%和26.4%;在灰霉菌胁迫下番茄植株内球孢白僵菌偏好于在病原菌感染位置定向聚集,并且引起植物抗病基因OXO、CHI和atpA的表达量上调。表明球孢白僵菌能通过内生定殖与植物互作提高植物抗病性,在植物病害生物防治领域有较大应用潜力。     

转基因水稻对稻瘟病的抗性研究

 采用苗期初筛、复筛、抗谱测定和田间自然诱发试验等不同鉴定方法,对经分子检测证明已整合有碱性几丁质酶基因和β-1,3-葡聚精酶基因的22个转化系的转基因水稻植株进行稻瘟病抗性鉴定研究,筛选出对稻瘟病的抗性比原种对照七丝软占有明显提高的一系列转基因水稻品系,其中表现高抗的有来自F4-9转化株系的7个品系。高抗材料的R7代品系,经室内抗谱测定及田间病圃试验结果,仍然表现高抗稻瘟病。本研究通过转基因技术,成功地将优质感病品种改良成高抗品系,研究结果证明了利用基因工程手段培育抗病水稻新品种是一个非常有希望的育种途径。     

抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育

 以大白菜栽培品种"福山大包头"的子叶柄为供试材料,对影响大白菜植株再生和基因转化频率的因素进行了研究。在此基础上,建立了大白菜高效再生体系和有效的基因转化体系,并将芜菁花叶病毒的CP基因(TuMV-CP)导入大白菜中,获得转化植株。PCR检测和Southern杂交分析证明TuMV-CP基因已整合于大白菜的基因组中;Northern杂交分析及EL ISA检测表明TuMV-CP基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。转基因植株T1代的遗传分析表明,外源基因在转基因植株后代中遵循3:1的分离规律。抗病性测定结果显示,转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

抗菌蛋白AP1编码基因对马铃薯的转化及其介导的青枯病抗性研究

根据已知马铃薯抗青枯菌蛋白AP1编码基因序列,合成了特异性引物,经PCR扩增、酶切以及连接、转化等分子操作,成功地获得了AP1编码基因植物表达载体pHap1,该载体具有-2E-P35S-12-ap1-结构。以电激法将pHap1导入根癌农杆菌LBA4404,用叶盘法转化马铃薯青枯病感病品种Mira、中-5-1及金冠试管苗,分别获得了卡那霉素(kan)抗性再生苗。经PCR、Southern、Northern检测,表明ap1基因已成功整合到转基因植株染色体上并正确表达。对Mira品种的转基因植株进行了青枯病抗病性鉴定,结果表明,转基因植株的抗病性比非转基因植株对照明显提高,发病或出现萎蔫症状的时间延迟、病情指数降低。     

枯草芽孢杆菌PTS-394诱导番茄对灰霉病的系统抗性

本文研究了枯草芽孢杆菌PTS-394对番茄的防御相关酶活性、抗病信号转导通路的标志基因表达的诱导情况和诱导抗病性对灰霉病的防治效果。结果显示,菌株PTS-394灌根番茄后,在24~72 h内番茄顶端叶片中PAL、PPO、POX、LOX的活性都有不同程度的持续增加,且72 h时达到最高峰值,随后在96 h下降,与对照相比差异显著;此外,番茄抗病信号通路节点基因NPR1和水杨酸(SA)信号通路激发的防卫基因PR-1a,在24~72 h得到了显著持续高表达。以上结果表明,利用菌株PTS-394灌根番茄后,能够诱导植株产生系统抗病性。菌株PTS-394灌根番茄后48 h,离体叶片挑战接种番茄灰霉菌,结果显示,菌株PTS-394处理的番茄叶片病斑面积仅为对照处理的50%,防控效果达47.1%;温室盆栽试验显示,菌株PTS-394处理后对番茄灰霉的防治效果为58.2%。综上所述,枯草芽孢杆菌PTS-394灌根番茄后,可以触发番茄植株系统性的抗病性,增强植株免疫能力。     

Genetic and molecular analyses of the incompatibility between Lolium isolates of Pyricularia oryzae and wheat

Pyricularia oryzae isolates from Lolium spp. (annual ryegrass and perennial ryegrass) show evidence of recent events in evolution of this fungus. A wheat blast isolate found in Kentucky in 2011 was assumed to originate from annual ryegrass isolates. Genetic analyses revealed that the incompatibility between a Lolium isolate and common wheat cultivars is controlled by two gene pairs, Rmg6–A1 with a strong effect and R2-A2 with a weak effect, implying that this incompatibility is conditioned by simple gene-for-gene interactions. Disruption of the A1 avirulence gene led the Lolium isolate to gain virulence on common wheat. These results suggest a mechanism for host jumping by the blast fungus.     

Gene amplification and insecticide resistance

Pesticide resistance in arthropods has been shown to evolve by two main mechanisms, the enhanced production of metabolic enzymes, which bind to and/or detoxify the pesticide, and mutation of the target protein, which makes it less sensitive to the pesticide. One route that leads to enhanced metabolism is the duplication or amplification of the structural gene(s) encoding the detoxifying enzyme, and this has now been described for the three main families (esterases, glutathione S-transferases and cytochrome P450 monooxygenases) implicated in resistance. More recently, a direct or indirect role for gene duplication or amplification has been described for target-site resistance in several arthropod species. This mini-review summarises the involvement of gene duplication/amplification in the insecticide/acaricide resistance of insect and mite pests and highlights recent developments in this area in relation to P450-mediated and target-site resistance.     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

瓜类果斑病菌致病基因及靶标基因的预测

哈密瓜果斑病是严重危害瓜类的种传细菌性病害,其病原菌为嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。本文首先用Bioedit软件建立瓜类果斑病菌全氨基酸序列本地资源库,运用比较基因组学的方法,通过大量查找嗜酸菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、木质部小菌属中的致病基因和参考文献中已报道的致病基因,下载相关致病基因的氨基酸序列,与瓜类果斑病菌的全氨基酸序列进行localblast,取E<10-5的为候选基因,得到果斑病菌中与致病性相关的基因,并对未知蛋白进行产物预测。同时,根据已经公布的靶标基因,用同样的比对方法,得到果斑病菌中潜在的靶标基因。本研究通过保守估计,得到77个致病性相关蛋白,预测了其中7个未知蛋白的产物,得到46个靶标蛋白。致病基因和靶标基因的分析预测,对以后研究此类基因提供了指导作用,为更好地防治该病害提供了理论基础。     

蝉棒束孢交配型基因的分析和检测

蝉棒束孢Isaria cicadae为药用真菌蝉花的无性型,在防治同翅目害虫上具有重要作用。在自然状态下蝉棒束孢多以孢梗束状态存在,其子实体阶段极为少见。交配系统是真菌有性生殖过程中的决定因素,因此可从交配型的角度探究蝉棒束孢有性子实体稀少的原因。本研究运用RACE技术首次从蝉棒束孢中克隆出MAT1-1-1与MAT1-2-1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。根据cDNA序列设计并优化得到蝉棒束孢交配型鉴定引物,并对采集自安徽地区40株蝉棒束孢交配型进行鉴定,结果表明交配型MAT1-1菌株14株、MAT1-2菌株26株,并没有检测到同时含有两种交配型或两种交配型全部缺失的现象,因此蝉棒束孢有性型子实体几无发生的现象并不完全归因于交配型因素。     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

In situ bioremediation of organochlorine‐pesticide‐contaminated microcosm soil and evaluation by gene probe

BACKGROUND: Pesticide‐formulating industries are contaminating the environment through various activities. Bioremediation is the best method for decontamination, as chemical and physical methods are not only costly but also not very effective in open field systems. In the present study, in situ bioremediation of organochlorine‐contaminated soil was demonstrated by combined biostimulation and bioaugmentation strategies, followed by evaluation using a molecular method. RESULTS: Three parameters were monitored: microbial biomass (colony‐forming units (CFU) g^?1 soil), residual pesticides after treatment and catabolic genes from microcosm soil. Both the biostimulation and the bioaugmentation treatments showed an initial lag phase of 80 days towards colony‐forming units. Gas chromatography of soil samples showed that concentrations of residual pesticides in the soil declined by up to 85–90% after 80 days, indicating their utilisation with time. On dot‐blot hybridisation of the total DNA from the same soil samples, it was observed that catabolic genes tfdC (catechol 1,2‐dioxygenase) and cm genes (chlorophenol monoxygenase) were predominant, whereas other catabolic genes such as catechol 2,3‐dioxygenase (xylE) were negligible. CONCLUSION: The strategy of in situ bioremediation and its evaluation by gene probe and also by conventional methods was demonstrated for organochlorine‐pesticide‐contaminated soil in open microcosms. It showed that bioaugmentation along with biostimulation was effective, although initial acclimatisation for a period of almost 2–3 months was required in the open field systems. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

西藏一种芥菜型油菜PGIP基因的克隆与序列分析

防治油菜菌核病的有效方法是培育抗菌核病的油菜品种。多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP),是植物体内一种重要的抗真菌蛋白。本研究根据NCBI中发表的PGIP基因序列设计引物,从芥菜型油菜‘藏油6号’中克隆得到全长1 048bp的PGIP基因序列。其核酸序列与NCBI数据库中登录的PGIP基因序列同源性为99%。该序列翻译后得到的氨基酸序列与NCBI上公布的油菜PGIP序列同源性为99%。该蛋白质序列中包含8个亮氨酸重复区(leucine-rich repeat,LRR)。过去研究结果显示芥菜型油菜比甘蓝型、白菜型油菜对菌核病的抗性普遍较高,但是未能搞清楚具体的原因,只是提出抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜中,其次是甘蓝型油菜中。通过研究证实了芥菜型油菜上PGIP基因具有保守性、疏水性,而且结构稳定,具有多个信号肽,能够高效地发挥其抗核盘菌的功能。今后在油菜育种上应利用芥菜型油菜的优势,发挥其抗病育种的潜力。     

宁夏马铃薯僵顶植原体的分子鉴定

通过透射电子显微镜,在从宁夏回族自治区固原市彭阳县红河镇采集的表现叶片上卷、红叶、气生薯症状的马铃薯样品叶脉韧皮部筛管细胞内观察到大量直径为500~700 nm的球形植原体粒子。以提取的感病和健康马铃薯叶片总DNA为模板,应用植原体16S rRNA基因和rp基因通用引物进行PCR扩增,从感病样品中扩增得到了长度均约为1.2 kb的片段。对获得基因核酸一致性比较分析表明,马铃薯僵顶植原体宁夏株系16S rRNA基因与‘Candidatus Phytoplasma fragariae’槭树株系(MK501642)16S rRNA基因核酸一致性最高,为99.7%,rp基因与‘Ca.P.fragariae’云南马铃薯YN-2G株系(KJ144889)rp基因核酸一致性最高,为100%;基于16S rRNA基因和rp基因构建系统进化树发现,马铃薯僵顶植原体宁夏株系与16SrⅫ-E亚组成员聚在一起。基于透射电镜观察和基因序列比较分析,证明宁夏发生的马铃薯僵顶病与植原体侵染相关,该植原体在分类地位上属于植原体16SrⅫ-E亚组。     

MrXrn1基因参与调控罗伯茨绿僵菌的产孢和致病

本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象，针对5'-3'核糖核酸外切酶基因（MrXrn1，MAA_09154，5'-3'exoribonuclease 1），利用农杆菌介导的同源重组方法进行基因敲除。对获得的MrXrn1基因敲除株（ΔMrXrn1）与野生型进行表型分析结果发现，与野生型相比，ΔMrXrn1的营养生长无明显变化，而产孢能力显著下降，其中产孢量降低了75.75%；以大蜡螟为试虫的体壁侵染毒力分析显示ΔMrXrn1的毒力显著减少，也即半致死时间（LT₅₀：9.16 d）显著长于野生型的（5.96 d），但注射接种情况下不同菌株的毒力无差异；进一步的研究表明ΔMrXrn1的附着孢形成率降低了43.58%。这些结果说明MrXrn1基因对绿僵菌的产孢及毒力起着重要的调控作用。本研究为进一步有效提高真菌杀虫剂的生防效果提供了基础。