模式植物二穗短柄草在禾本科作物与病原互作研究中的应用

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)因其基因组小、株型小、自花授粉、一年生、生命周期短、有二倍体和一系列多倍体、易培植、易转化等诸多优点,正逐渐成为一种理想的禾本科作物模型。最近的研究表明,二穗短柄草对许多主要的禾谷类作物病原菌敏感。因此,研究二穗短柄草-病原菌的相互作用可以提高人们对禾本科作物抗病能力的认识。本文综述了二穗短柄草与真菌、病毒和其他禾谷类作物病原菌互作的研究成果,以及利用二穗短柄草进行禾本科作物抗病机制研究的现状。展望了二穗短柄草作为作物-病原体相互作用的研究模型的发展前景。     

耐性和敏感两种类型鲜食玉米苗期施用硝磺草酮后的转录组分析

苗期施用硝磺草酮易对鲜食玉米品种和自交系造成药害。鲜食玉米对硝磺草酮的不同响应差异可能归因于除草剂代谢效率的不同。本研究从氧化损伤和光合抑制角度阐述了不同耐药性鲜食玉米对硝磺草酮的响应差异。利用RNA-Seq技术对耐性和敏感玉米在硝磺草酮处理和未处理下的基因表达情况进行了分析,以期从生理和分子水平揭示鲜食玉米对硝磺草酮的耐性机制。结果表明:硝磺草酮处理导致敏感玉米自交系叶片中积累更多的活性氧,光合作用受到严重抑制,最终植株干枯死亡;而耐性玉米自交系在硝磺草酮处理后植株生长正常。本研究中,共鉴定到7985个差异表达基因,敏感玉米中上调表达基因4020个、下调表达基因3450个,而耐性玉米中上调表达基因526个、下调表达基因495个;差异表达基因的基因功能注释 (GO) 富集分析表明:差异表达基因数量较多的主要集中在分子功能、细胞组分、生物学过程中;京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 分析显示:差异表达基因显著富集在光合作用、碳水化合物、氨基酸和脂类代谢等相关通路;筛选到Zm00001d042099、Zm00001d044157、Zm00001d007462、Zm00001d002436、Zm00001d021804、Zm00001d042541、Zm00001d040764、Zm00001d032828和Zm00001d020544共9个可能参与除草剂代谢的潜在候选基因。     

链霉菌769与百日草黑斑病病菌诱导百日草几丁质酶基因的表达差异

以百日草为试验材料,利用同源基因克隆法克隆到百日草几丁质酶基因片段和actin基因片段,分别用链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液处理百日草植株,通过半定量RT-PCR检测了不同处理的几丁质酶基因表达量的差异.结果表明,链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液均能诱导百日草几丁质酶基因的表达,其最大表达量分别在接种后24 h和6h.百日草黑斑病病菌优先诱导植株体内几丁质酶的表达,而链霉菌769的诱导滞后.当用病原菌处理36 h后喷施链霉菌769发酵液,链霉菌769对几丁质酶基因的诱导表达高峰出现在喷施后的36 h,比单独喷施的诱导表达推迟了12h,暗示了生防菌链霉菌769可以诱导植物的系统诱导抗性,且和百日草黑斑病病菌引发了不同的信号转导通路,以减轻由病原菌侵染引发的植物病害.     

小麦脱水素wzy1-2基因的遗传转化及干旱胁迫下不同生育期表达水平

根据同源分析,在脱水素wzy1-2基因序列中选择298bp的cDNA序列作为干扰片段,将其插入高效植物干扰表达载体pTCK303的多克隆位点,成功构建含反向重复序列的RNA干扰表达载体。采用基因枪法轰击2512个郑引1号小麦的幼胚愈伤组织,获得再生植株26株,对其T_0代再生植株进行特异引物PCR检测,获得6株阳性植株,阳性转化率为0.24%。对脱水素wzy1-2基因实时定量分析发现,小麦中目的基因表达量显著下降。为进一步了解该基因在小麦整个生长过程中表达模式,选取2个不同抗旱性小麦品种(陕合6号和郑引1号),分别在小麦4个不同生长时期(苗期、分蘖期、拔节期和开花期)进行干旱胁迫处理,分析脱水素wzy1-2基因的表达规律。结果表明,随着干旱程度增加小麦WZY1-2蛋白的表达量升高;苗期小麦WZY1-2蛋白的表达量均高于其它3个生长时期。Western blot分析显示陕合6号和郑引1号的非特异性条带单一,表明小麦脱水素wzy1-2是干旱诱导型基因。     

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法,通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1 069 bp的半夏凝集素基因pta,与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高,达到98%以上,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区,GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因,正向插入35S启动子之下,构建了植物表达载体pBI-pta。通过农杆菌介导法转化烟草,从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株,证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫(Myzus persicae)筛选试验,结果表明:不同株系蚜口密度抑制率在22.5%~89.4%,平均蚜口密度抑制率56.2%。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

大豆疫霉细胞凋亡相关基因的鉴定与表达分析

为探讨大豆疫霉Phytophthora sojae细胞凋亡潜在的调控机制,根据已知的细胞凋亡蛋白,利用在线工具BLASTP、pFAM和SMART在大豆疫霉蛋白组数据库中鉴定细胞凋亡同源蛋白并构建其进化树,通过转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析细胞凋亡相关基因在大豆疫霉生长、发育及侵染不同时期的表达情况。结果显示:在大豆疫霉中共鉴定到13个细胞凋亡同源蛋白,包括核酸内切酶G(PsNUC1)、细胞色素c(PsCYCS)、凋亡诱导因子(PsAIF)、丝氨酸蛋白酶(PsHtrA-1、PsHtrA-2和PsHtrA-3)、多聚ADP核糖聚合酶(PsPARP-1、PsPARP-2和PsPARP-3)和TatD核酸酶(PsTatD1、PsTatD2、PsTatD3和PsTatD4)。在进化上,PsNUC1、PsCYCS、PsAIF、PsHtrA-1、PsPARP-1、PsPARP-2、PsPARP-3、PsTatD1和PsTatD2与人及秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的同源蛋白亲缘关系较近,而与真菌相关蛋白亲缘关系较远,PsHtrA-2、PsHtrA-3、PsTatD3和PsTatD4与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae相关蛋白相似度更高,说明大豆疫霉细胞凋亡蛋白在进化中发生了较大变异。大豆疫霉细胞凋亡相关基因PsHtrA-1和PsRARP-1在孢子囊阶段诱导表达,PsHtrA-2和PsRARP-2在游动孢子阶段上调表达,PsAIF、PsHtrA-3、PsRARP-1和PsRARP-2在侵染阶段明显诱导表达,PsCYCS在侵染阶段下调表达。细胞凋亡相关基因在大豆疫霉不同阶段的表达模式有较大差异,说明细胞凋亡在大豆疫霉生长、发育及致病过程中具有重要作用。     

怎样使用植物细胞分裂素

植物细胞分裂素是一种植物生长调节剂。它有促进叶面积增加,使作物增产,促进蛋白质增加改善作物品质提高抗病性、抗寒性的作用。粮食作物可增产10%—15%,蔬菜、瓜果等经济作物增产15%—20%,对番茄、烟草病毒病有70%以上的防治效果。应用植物细胞分裂素可用浸种或喷雾的办法,如两种方法结合使用,效果更好。     

球孢白僵菌定殖提高番茄对灰霉病抗性及其作用机理

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana定殖对番茄植株抗病性的影响及作用机理,采用灌根法将球孢白僵菌芽生孢子悬浮液接种于番茄植株内,并通过人工接种灰霉菌Botrytis cinerea评价球孢白僵菌定殖后番茄对灰霉病的抗性水平;检测灰霉菌胁迫下番茄植株不同位置叶片内球孢白僵菌的相对含量;测定番茄叶片内草酸氧化酶（oxalate oxidase,OXO）、几丁质酶（chitinase,CHI）和ATP合成酶（ATP synthase,atpA）3种抗病相关基因的表达量。结果表明,球孢白僵菌定殖能够提高番茄植株对灰霉病的抗性,接种灰霉菌第5天,番茄植株发病率、病斑直径和病情指数分别下降了61.6%、41.4%和26.4%;在灰霉菌胁迫下番茄植株内球孢白僵菌偏好于在病原菌感染位置定向聚集,并且引起植物抗病基因OXO、CHI和atpA的表达量上调。表明球孢白僵菌能通过内生定殖与植物互作提高植物抗病性,在植物病害生物防治领域有较大应用潜力。     

瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染

 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi途径的重要中介,已被广泛应用于动、植物抗病毒治疗研究。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成表达小干扰RNA的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的siRNA能够特异性干扰TMV侵染。含有重组表达载体pBI121/siRNA的根癌农杆菌渗入普通烟植株,在TMV接种后14d其上部叶片没有表现典型的花叶症状。对这些叶片进行Northern杂交试验也没有检测到TMV病毒的RNA积累或仅有很少量的积累。在枯斑寄主心叶烟上,siRNA的瞬时表达可使TMV侵染后的枯斑数明显减少,甚至不产生枯斑。此外,同源于TMV外壳蛋白的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)没有抑制作用,表明siRNA的干扰作用具有高度的同源依赖性。     

向日葵3个谷胱甘肽-S-转移酶GST基因的克隆及表达模式分析

从向日葵转录组测序结果中获得了3个对盐胁迫有响应的谷胱甘肽-S-转移酶（GST，EC2.5.1.18）GST基因，构建了系统进化树并进行分析，得知这3个基因属于Tau型GST，并将它们命名为HaGSTU26（HanXRQChr04g0127901）、HaGSTU8（HanXRQChr06g0177581）、HaGSTU27（HanXRQChr10g0316331），然后以向日葵Sk02R为试验材料，克隆这3个基因，并进行了不同组织和不同胁迫条件下的表达分析。序列分析表明：HaGSTU26基因组为1674bp，CDS（编码蛋白序列）长666bp，编码221个氨基酸，由2个外显子和1个内含子组成；HaGSTU8基因组为2271bp，CDS长654bp，编码217个氨基酸，由2个外显子和1个内含子组成； HaGSTU27基因组为663bp，CDS长663bp，编码220个氨基酸,由1个外显子组成。实时荧光定量PCR分析表明：向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因在不同组织（根、幼叶、成熟叶、茎、幼茎、苞叶）中表达量不同，其中，HaGSTU26基因和HaGSTU27基因在根中表达量最高，而HaGSTU8基因在苞叶中表达量最高，但这3个基因均在成熟茎中的表达量最低。在不同胁迫条件下，测定这3个基因在向日葵幼苗中的表达量，结果表明在盐及ABA胁迫下，基因表达量均随着处理时间的增加而呈现先增加后下降的趋势。其中，在盐胁迫下，HaGSTU26基因在12 h后相对表达量最高，HaGSTU8及HaGSTU27基因表达量在3h后相对表达量最高。在ABA胁迫后，HaGSTU26及HaGSTU27基因表达量在12 h后相对表达量最高，HaGSTU8在24 h后相对表达量最高。在冷胁迫下，HaGSTU26和HaGSTU27基因上调表达,它们分别在3、24 h后相对表达量最高，HaGSTU8基因下调表达，其相对表达量随处理时间的延长呈现逐渐减少的趋势。在热胁迫条件下，这3个基因的相对表达量随着胁迫时间的延长而增加,均在24 h后表达量最高。以上结果说明这3个基因对不同非生物胁迫（盐、ABA、冷、热胁迫）均有响应。     

Elucidation of defence responses and signalling pathways induced in Arabidopsis thaliana following challenge with Phytophthora cinnamomi

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Col-0 was inoculated with Phytophthora cinnamomi to assess the interaction and defence responses involved. Pathogen ingress and asexual reproduction occurred on root tissue but not leaf tissue. The colonisation of root tissue did not cause disease symptoms or plant death, indicating that Arabidopsis Col-0 was tolerant of the infection. The induction of several plant defence responses including the expression of defence-related genes were found, with differences displayed between inoculated root and leaf tissue. Arabidopsis defence-related gene mutant/over-expressing lines were also inoculated with P. cinnamomi but none of the lines tested exhibited a marked increase in susceptibility to the pathogen.     

芹菜APX基因家族鉴定及其表达分析

抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase, APX）是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，在植物抵抗氧化胁迫方面发挥重要作用。利用生物信息学方法对芹菜基因组中的APX基因家族成员进行鉴定和分析，并通过实时荧光定量PCR（quantitative real\|time PCR, qRT-PCR）验证分析AgAPXs在高温胁迫下的表达情况，为开展芹菜APX基因参与高温胁迫调控机制提供依据。结果表明：芹菜基因组中共有9个APX基因，随机分布在5个染色体上，并出现了基因片段复制现象；大多数基因被定位在细胞质中。系统发育分析表明，AgAPX基因家族可分为3个亚族，同一亚族中的成员具有相似的基因结构和基序。启动子顺式元件分析表明，大多数AgAPX基因含有多种与生长发育、植物激素和逆境胁迫相关的顺式元件。高温胁迫下，芹菜APX活性提高。qRT-PCR分析表明，AgAPXs在不同时间的高温处理下表达具有显著差异，并与转录组表达丰度相一致，AgAPX2、AgAPX3、AgAPX4、AgAPX5、AgAPX7的表达量和APX活性具有显著相关性，推测AgAPXs可能参与了芹菜抵御高温的调控过程。本研究初步鉴定并提供了芹菜APX基因家族成员信息，为今后进一步探索芹菜APX基因功能提供了重要的研究基础。     

基于链特异性RNA-seq的禾谷镰刀菌全生活史转录组分析

为明确植物病原真菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum全生活史的转录组特征和基因表达模式,采用生物信息学技术对其生活史不同阶段15个时期或组织的链特异性RNA-seq数据进行分析。结果表明,共有8 106个基因在所有时期均有表达,为禾谷镰刀菌生活史核心基因,占总基因数的47.2%;有性生殖和侵染过程中表达的基因数相对较多,其中有性生殖后期表达的基因数最多,达15 221个;无性产孢和侵染小麦穗过程中基因表达水平整体较高,而分生孢子中基因表达水平最低。在燕麦培养基上禾谷镰刀菌气生菌丝的基因表达模式与侵染过程中的基因表达模式较为相似,而与营养生长菌丝的基因表达模式差异较大。该菌次生代谢物合成特征酶基因和分泌蛋白基因的表达模式均分成3类,即分别在侵染、营养生长和有性生殖过程上调表达,暗示其在生活史不同阶段的特异性功能。     

Identification of differentially expressed genes in the mutualistic association of tall fescue with Neotyphodium coenophialum

Tall fescue (Lolium arundinaceum), an agronomically important forage grass, is typically associated with a mutualistic asexual fungus Neotyphodium coenophialum. Plant colonization is endophytic with no symptoms, and fungal growth is confined to the intercellular spaces. The endophyte enhances host fitness by providing protection from various abiotic and biotic stresses and by improving nutrient acquisition. By suppression subtractive hybridization (SSH) we identified 29 genes that are up-regulated or down-regulated in endophyte-infected tall fescue as compared to endophyte-free tall fescue. Of the genes that had matches to known genes present in the NCBI databases (approximately 50%), several had roles related to plant defense and stress tolerance. Differential expression of these genes was confirmed by semi-quantitative RT-PCR, competitive RT-PCR, and northern hybridization. Endophyte-associated changes in gene expression patterns were consistent among cultivars of tall fescue but differed in some other grass–endophyte associations. Our results indicate that both partners in this symbiosis are active participants, and that the endophyte may be suppressing at least one plant defense gene (putatively encoding PR-10). Further analyses of the differentially expressed genes should aid in understanding the fundamental nature of this mutualistic symbiosis and provide insight into the mechanisms of documented endophyte-enhanced plant improvements.     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子，调控多种DNA代谢，在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚，为此，本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4，利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式，利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除，然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析，并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调，接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏，在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%，VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%；综上所述，Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

寡雄腐霉GAQ1对辣椒疫病的防效及对辣椒的促生作用

为明确自主分离的生防菌株寡雄腐霉Pythium oligandrum GAQ1对辣椒疫病的生防效果及其防御机制,通过平板拮抗和盆栽防效试验测定寡雄腐霉菌株GAQ1对辣椒疫霉Phytophthora capsici菌丝的拮抗作用、对辣椒疫病的防效和对辣椒的促生效果,同时应用实时荧光定量PCR技术检测菌株GAQ1处理后辣椒抗性基因表达的变化。结果表明,寡雄腐霉菌株GAQ1的菌丝可以缠绕并吸附寄生在辣椒疫霉菌丝表面或穿入菌丝体内,使辣椒疫霉菌丝细胞死亡;菌株GAQ1发酵液处理辣椒离体叶片再接种辣椒疫霉后产生的病斑直径较对照组显著减少,离体防效为30.79%;接种菌株GAQ1菌丝球后,辣椒疫病的病情指数较对照组显著降低,盆栽防效达69.16%;经菌株GAQ1处理辣椒后可诱导相关抗性基因PR1、WRKY40、WRKY53、ACCO和GST的相对表达量出现不同程度的升高,说明菌株GAQ1可诱导辣椒植株产生不同程度的防御系统应答。菌株GAQ1对辣椒具有良好的促生效果,处理后第5周其株高、株重及根重分别较对照组提高10.11%、33.23%和24.72%,其叶片中叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量分...     

Q型烟粉虱芳香基硫酸酯酶B基因的克隆及表达分析

为明确烟粉虱Bemisia tabaci取食感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄植株后,其体内的芳香基硫酸酯酶B基因(arylsulfatase B,ARSB)是否能够做出应答反应,基于Q型烟粉虱基因组数据克隆得到ARSB基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析其序列特征,并通过实时荧光定量PCR技术测定ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段、不同组织及携带TYLCV前后的表达量变化情况。结果显示:Q型烟粉虱ARSB基因的cDNA全长为1 731 bp,编码576个氨基酸,分子量为64.89 kD,具有ARSB的保守结构域。ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段均有表达,在卵期表达量最高,成虫期表达量最低;该基因在Q型烟粉虱头胸部的表达量显著高于腹部;Q型烟粉虱获取TYLCV 72 h后其体内ARSB基因表达量显著提高。表明ARSB基因在Q型烟粉虱不同龄期、不同组织内存在差异表达,并可能参与Q型烟粉虱对TYLCV的响应和传毒过程。     

棉铃虫BR-C Z4基因的克隆及表达分析

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad-complex,BR-C）Z4亚型在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理的棉铃虫幼虫中肠转录组数据克隆获得BR-C Z4的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,对其氨基酸序列和编码蛋白质进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）技术分析BR-C Z4基因在棉铃虫不同龄期、不同组织和2-TD处理6龄幼虫中的表达规律以及其和Ⅳ型几丁质酶（chitinase IV,CHT4）编码基因在4~6龄初、末期幼虫中的表达规律。结果表明,克隆获得的棉铃虫BR-C Z4基因的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量和理论等电点分别为49.8 kD和7.75,且主要定位于细胞核中。系统进化分析结果显示,棉铃虫BR-C Z4与家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta的BR-C Z4亲缘关系最近。BR-C Z4基因在棉铃虫整个生长期均有表达,在3龄期的相对表达量最低而在预蛹期的相对表达量最高;该基因在棉铃虫6龄幼虫的脂肪体、中肠、体壁和头部均有表达,在头部的相对表达量最低,在中肠中的相对表达量最高; BR-C Z4和CHT4基因在棉铃虫4~6龄末期幼虫中的相对表达量均显著高于4~6龄初期幼虫;相关性分析结果显示BR-C Z4和CHT4的相对表达量呈极显著正相关;随着2-TD处理浓度的增加,棉铃虫BR-C Z4基因的相对表达量总体呈现先上升后下降的趋势,其中15 mg/g浓度处理20 h时BR-C Z4基因相对表达量达到峰值,而20 mg/g浓度处理6 h时BR-C Z4基因相对表达量降到最低,为对照的22.73%。推测BR-C Z4基因在棉铃虫变态发育和应对2-TD胁迫过程中发挥着重要作用。