链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核相关基因的EST生物信息学分析

链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum是一种重要的菌寄生真菌,为了明确该菌与寄主核盘菌Sclerotinia sclerotiorum互作中参与菌寄生过程的功能基因,本实验室前期采用抑制消减杂交技术(SSH)构建了消减cDNA文库.本文从该库里随机挑选420个阳性克隆进行测序分析,结果表明克隆片段大小在200～600bp的序列占81.07%.去除载体和小于100bp的序列,获得391条有效序列,其平均长度为409bp.通过序列拼接得到181个单值基因(unigenes),其中包括27个重叠群(contigs)和154个单拷贝的ESTs(singletons).将得到的ESTs与NCBI非冗余蛋白数据库(NR)进行BLASTx分析,结果显示有38个基因的编码蛋白与已知功能的蛋白有较高的相似性,其中包括可能与生物防治功能相关的内切葡聚糖酶、脂滴包被蛋白、MFS转运蛋白、过氧化物酶等;有39条序列在NCBI数据库中未找到相似序列,可能为新基因;其他基因的编码蛋白与数据库中功能未知蛋白相似性高.本研究为明确与重寄生功能相关的基因奠定了基础.     

粉红粘帚霉67-1菌株寄生核盘菌研究

 用诱捕法从海南乐东县菜园土壤中获得一株对核盘菌菌核具有强寄生能力的粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)菌株67-1,寄生频率为100%。该菌的PDA平板回接核盘菌菌核,一周后寄生率可达100%。对峙培养发现其对核盘菌有明显的抑菌带。保湿条件下,该菌孢子在24h内成功侵入核盘菌菌核。切片显微观察证明该菌能高效侵染菌核,造成组织溃解。寄生过程中菌核内蛋白组成发生明显变化。这一菌株在22~35℃均能很好生长,菌丝及产孢最适温度为24℃,产孢量大。认为这一菌株具有良好的菌核病生防应用潜力。     

核盘菌菌核围微生物群落分析及其对盾壳霉重寄生的影响

 重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种生防菌,它通过寄生核盘菌菌核,减少初侵染来源,从而达到防病效果。但在田间自然土壤中,核盘菌菌核围微生物对盾壳霉寄生菌核的影响还不清楚。本研究对核盘菌菌核围微生物进行了分离鉴定,并评估了菌核围细菌对盾壳霉重寄生的影响。结果表明,不同取样时间和不同深度的核盘菌菌核围土壤中,均存在可培养微生物富集的“菌核围效应”,即菌核围土壤中可培养细菌数量和真菌数量均高于非菌核围土壤。从菌核围土壤中共分离获得了253株细菌和180株真菌,并对其中的代表菌株进行了分子鉴定,发现假单胞菌属(Pseudomonas)和芽胞杆菌属(Bacillus)是菌核围细菌的优势种群,青霉属(Penicillium)是菌核围真菌的优势种群。通过平板对峙,从菌核围细菌中筛选到25个菌株对核盘菌有拮抗活性,22个菌株对盾壳霉具有拮抗活性。砂皿寄生菌核试验证实,7株菌核围细菌对盾壳霉寄生菌核有显著的抑制作用。核盘菌菌核围细菌对盾壳霉重寄生的抑制作用,可能是导致盾壳霉田间生防效果不稳定的原因之一。     

盾壳霉对核盘菌的拮抗作用研究

系统研究了菌核重寄生菌盾壳霉对核盘菌的拮抗作用,结果表明:盾壳霉可在核盘菌菌落上寄生,使核盘菌菌丝消解、原生质泄露,并抑制菌核的形成;而且盾壳霉提前6d接种,其分泌的抗生物质还可抑制核盘菌菌丝生长,并产生明显抑菌带。盾壳霉孢子液喷雾处理也证明:盾壳霉分生孢子即可在核盘菌子囊盘(柄)上萌发、寄生,使子囊盘(柄)萎缩枯死,而且还可以在核盘菌菌落上萌发、寄生,消解破坏菌丝体、抑制的菌核形成。     

影响盾壳霉寄生核盘菌菌核的几个生态因子的分析

 在室内测定了盾壳霉(Coniothyrium minitans)对不同寄主上的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核的寄生致腐作用,研究了温度、含水量和土壤类型等生态因子对核盘菌菌核的寄生致腐作用的影响,通过检测土壤的呼吸速率探讨了它在土壤中定殖与核盘菌菌核的关系。结果表明:盾壳霉能寄生致腐核盘菌属所有供试菌株的菌核;寄生致腐菌核的最适温度是20℃,最适相对含水量为50%~60%;盾壳霉在供试的8种土壤中均能寄生致腐菌核,对它们的pH值要求不严格,但土壤类型影响其寄生致腐速度;在土壤中添加菌核和菌核提取液都可不同程度地刺激它的生长。     

铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库的构建及质量分析

为了研究铜绿丽金龟(Anomala corpulentaMotschulsky)成虫嗅觉相关蛋白的功能,本文以铜绿丽金龟雌成虫触角为原始材料提取总RNA,利用SMART技术构建了铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库。经测定,原始文库滴度为6.74×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为1.08×1010pfu/mL,文库重组率为98.98%。随机挑取24个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段的大小在0.5~2.0kb之间,片段平均长度为1.0kb左右。经过菌液PCR并测序筛选cDNA文库,本试验获得了两条编码气味结合蛋白的全长基因序列AcorOBP1和AcorOBP2。以上数据表明,已获得高质量的铜绿丽金龟触角全长cDNA文库,并筛选、克隆获得了气味结合蛋白基因序列。这为进一步研究触角内气味结合蛋白的功能奠定了基础。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

除草剂精禾草克和乙草胺对油菜菌核病生防菌盾壳霉生长和寄生的影响

本文研究了油菜田间常用除草剂精禾草克和乙草胺对油菜菌核病生防菌盾壳霉Conio-thyrium minitans的影响。结果表明它们对盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用,其中精禾草克对盾壳霉菌丝生长和孢子萌发的抑制中浓度分别为2.95mg/L和7.80mg/L;乙草胺对菌丝生长和孢子萌发的抑制中浓度分别为137.45mg/L和120.90mg/L。精禾草克可以抑制盾壳霉寄生核盘菌Sclerotinia sclerotiorum菌核,当精禾草克的使用量达田间使用浓度时,盾壳霉不能寄生核盘菌菌核;而乙草胺对盾壳霉寄生菌核的影响较小,在田间使用浓度1250mg/L时,盾壳霉仍可寄生菌核;乙草胺和盾壳霉在田间使用浓度条件下混合使用,60d后菌核腐烂指数与单独使用盾壳霉没有显著差异,均大于75。上述结果表明在田间使用量条件下,乙草胺可以和盾壳霉生防制剂混用,而精禾草克不宜和盾壳霉混用。     

用酵母双杂交筛选与南瓜蚜传黄化病毒MP互作的寄主因子

植物病毒编码的移动蛋白(movement protein,MP)介导病毒在寄主体内的移动,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染过程中的分子机制。将南瓜蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus(CABYV)MP基因定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding domain,BD)载体上,并构建与激活功能域(activation domain,AD)融合表达的西瓜茎叶cDNA文库,然后用MP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵质粒插入的MP基因可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株AH109和Y187没有自主激活能力;文库滴度为2.94×106CFU/mL,且大多数插入片段在700bp以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有48个候选阳性克隆与MP在酵母中互作。测序得到这些克隆的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些克隆共编码12种蛋白。     

Culex pipiens pallens: identification of genes differentially expressed in deltamethrin-resistant and -susceptible strains

Insecticide-resistance is a major obstacle to controlling insect vectors of microorganisms that cause human diseases. Identification of genes associated with resistance to insecticides has been a valuable tool for understanding mechanisms underlying resistance to commonly used insecticides such as deltamethrin. To identify such genes, we used suppression subtractive hybridization to obtain 809 differentially expressed clones in deltamethrin resistant versus susceptible laboratory strains of Culex pipiens pallens. Using cDNA microarrays and reverse Northern blots, a subset of 16 clones was confirmed to have greater than 3-fold difference in expression levels. Within this subset, we identified 2 clones uniquely expressed in the deltamethrin-resistant strain, eight clones exhibiting higher expression in the resistant strain and six in the susceptible strain. Of these 16 clones, 13 clones have sequence homology to known genes, such as ribosomal RNA, ribosome proteins, trypsin, and chymotrypsin-like proteins. Our data suggests resistance to deltamethrin may be a polygenic phenotype.     

香蕉果实炭疽病病程相关基因cDNA片段克隆

 A suppression subtractive hybridization(SSH) cDNA library was constructed from 5 d lesion of banana fruit inoculated with Colletotrichum musae F1.70 cDNA clones selected randomly were sequenced and analysed.The result showed that 29 cDNA clones were related to disease resistance.They were chitinase,se-rine/threonine phosphate,Leucine-rich repeat(LRR),isoflavone reductase and so on.     

Antagonistic activity of fungi isolated from sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum

Fungi isolated from soils in central Italy by a baiting technique with sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum were evaluated for their antagonism in vitro to this fungus using dual cultures and tests with sclerotia. Trichoderma spp., Coniothyrium minitans and species of Fusarium and Penicillium all showed strong antagonistic activity. Morphological alterations were observed in the mycelium of S. sclerotiorum. Trichoderma spp. and Gliocladium catenulatum killed a very high percentage (96–100%) of the sclerotia.     

条锈菌诱导的小麦抑制差减杂交文库构建及其表达序列标签研究

 利用抑制差减杂交技术构建了条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的小麦叶片cDNA文库。文库质量检测表明:差减杂交效率较高,质量较好。用DNAStar 5.0对172条高质量的ESTs进行聚类,共获得120个contigs。对功能已知的contigs分类,能量和初级代谢类占32.5%,其中与光合作用相关的基因出现频率最高;参与膜及转运、抗病与防御的基因分别位于第二、三位;次生代谢、蛋白质合成加工和细胞结构建成的基因较少。通过分析抗病相关基因,初步推测HR和SAR可能为小麦抗条锈病过程中的2种抗性形式。最后利用RT-PCR对4条感兴趣基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

稻瘟病菌附着胞差异表达基因文库的构建方法

 利用抑制性差减杂交方法构建了稻瘟病菌分生孢子接种24h所形成的附着胞差异表达基因文库。采用复印胶片诱导稻瘟病菌附着胞形成,在孢子浓度为1.0×10⁶个/mL时,附着胞的形成率达到96.5%。分别提取附着胞、菌丝和分生孢子RNA,反转录成cDNA并经Alu Ⅰ酶切、接头连接后,以附着胞cDNA片段为tester,菌丝及分生孢子cDNA为driver进行抑制性差减杂交,构建成差减文库。从文库中分离获得142个基因片段,通过RT-PCR方法鉴定其中的71个为差异表达基因,证实文库高效可靠。构建优质的稻瘟病菌附着胞差异表达基因差减文库,为深入了解附着胞形成过程中基因的表达及功能奠定了基础。     

玉米纹枯病菌全长cDNA文库的构建与鉴定

 以玉米纹枯病菌菌丝为材料,利用In-Fusion SMARTer^TM cDNA Lib Construction Kit构建玉米纹枯病菌全长cDNA文库。文库质量鉴定结果表明,文库滴度为1.2×10⁶pfu·mL^-1,重组率为99.2%,插入片段平均长度大于1.0 kb。随机挑取400个白色克隆进行测序,共获得329个高质量EST序列,经聚类拼接后得到250条unique EST,包括36条contigs和214条singletons。在GenBank 进行Blastn 与Blastx 同源比对,有227条EST 与已知核酸或蛋白有不同程度的同源性,占全部EST 的90.8%,其余23条无任何同源性,占9.2%。